Utilização de técnicas microbiológicas na avaliação da eficiência de um sistema de HACCP a nível de adega

Tese de mestrado. Biologia (Microbiologia Aplicada). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011É por demais conhecida a importância que o vinho tem, desde longa data, na agricultura, na gastronomia, na economia e na sociedade. Assim, nos últimos séculos, a produção de vinho tem sofrido significativos progressos tornando-se, desta forma, objecto de interesse científico que visa o conhecimento das inúmeras variáveis que alteram o processo de vinificação.Leveduras e bactérias são responsáveis pelas fermentações alcoólica e maloláctica mas desempenham também um papel central na deterioração de alimentos e bebidas. Deste modo, demonstra-se essencial ter um melhor conhecimento da microbiota das uvas e do ambiente microbiológico da adega, para estabelecer a origem das leveduras de deterioração dos vinhos, as suas rotas de contaminação, os seus pontos críticos, e, claro, do seu controlo.Nesta dissertação, procedeu-se à avaliação microbiológica dos procedimentos de higiene em diversas áreas críticas de contaminação de uma adega (Quinta Monte d‟Oiro), enquadradas nos pré-requisitos de um sistema de HACCP. Em dois períodos do mesmo ano, após os procedimentos de higiene, fez-se a análise de microrganismos existentes nos equipamentos. Para uma melhor compreensão da flora microbiana, e na tentativa de conhecer as vias/fontes de contaminação, foram utilizados métodos fenotípicos e técnicas moleculares que permitiram, deste modo, identificar e/ou diferenciar as espécies ou estirpes responsáveis pela contaminação/degradação do produto final.Este trabalho foi dividido em três fases, procedendo-se inicialmente à recolha e inoculação das amostras, e purificação e caracterização morfológica e bioquímica dos isolados; permitindo agrupar os isolados com base nas suas características fenotípicas. Numa segunda etapa, identificaram-se 14 espécies diferentes de leveduras através da técnica de RFLP-PCR e da sequenciação da região D1/D2 do rDNA 26S. As espécies que mais se evidenciam foram Hanseniaspora uvarum, Pichia menbranifaciens, Rhodotorula mucilaginosa e Candida ishiwadae, por terem capacidade de causar maus paladares e por algumas delas se encontrarem em concentrações elevadas nos respectivos locais de amostragem. Finalmente, procedeu-se à identificação das bactérias, utilizando-se o método do csM13-PCR. Numa análise global, consideraram-se as estirpes de cada „cluster‟ (ao nível de 77%) formados pelos perfis de csM13-PCR „fingerprinting‟. Após análise conjunta dos resultados obtidos pela abordagem polifásica permitida pelos perfis de csM13-PCR, sequenciação de rDNA 16S a partir de alguns isolados de cada „cluster‟ e tipificação morfológica foi possível a identificação de isolados revelando 18 espécies diferentes.De acordo com o objectivo principal desta dissertação, e na sequência da estratégia adoptada, foi exequível retirar ilações sobre o nível de higiene dos equipamentos, matérias e outros elementos existentes na adega e quais os principais pontos críticos que se deve ter em conta para evitar contaminações enológicas e recomendações ao melhoramento do plano de HACCP implementado nesta adega. The importance of the wine in agriculture, food, economy and society it is well known for a long time. In the last centuries, the wine production has progress significantly and becoming the subject of scientific interest in order to understand the many variables that affect the winemaking process. Yeasts and bacteria are responsible for the alcoholic and malolactic fermentations but also play a central role in the deterioration of foods and drinks. Thus, it is essential to have a better knowledge of the microbiota of the grapes and of the microbial environment of the wine cellar to establish the origin of the wine deterioration microorganisms, their routes of contamination, critical points, and of course it´s control.In this dissertation, we proceeded to the microbiological evaluation of hygiene procedures in several critical areas of contamination of a wine cellar (Quinta Monte d'Oiro), framed in the prerequisites of a HACCP system. In two periods of the same year, after the hygiene procedures, the analysis of microorganisms in the equipment was performed. For characterization of the microbial flora and an insight of the routes/sources of contamination, we applied phenotypic methods and molecular techniques that allowed to identify and/or differentiate the species or strains responsible for the contamination/degradation of the final product. This work was divided into three phases. The collection and inoculation of samples, purification, biochemical and morphological characterization of isolates allowed grouping the isolates based on phenotypic characteristics. In a second step, we identified 14 different species of yeasts based on the PCR-RFLP technique and by sequencing D1/D2 region of 26S rDNA. The species that were more noted were Hanseniaspora uvarum, Pichia menbranifaciens, Rhodotorula mucilaginosa and Candida ishiwadae due to their potential to cause bad taste and also because some of them are in high concentrations in the respective sampling sites. Finally, we proceeded to the identification of bacteria using the csM13-PCR fingerprinting and evaluated the clusters formed at 77% similarity. The polyphasic approach by the csM13-PCR profiles, sequencing of 16S rDNA for some isolates of each csM13-PCR cluster and morphological typification, allowed the identification of isolates, revealing 18 different species. According to the main objective of this dissertation, and following the adopted strategy, it was feasible to conclude about the level of hygiene of the equipments, raw materials and other elements in the cellar and identify the main critical points that should be taken into account to avoid oenological contamination as well as some recommendations to improve the HACCP plan implemented in the cellar