Exploring nervous system transcriptomes during embryogenesis and metamorphosis in Xenopus tropicalis using EST analysis

<p>Abstract</p> <p>Background</p> <p>The western African clawed frog <it>Xenopus tropicalis </it>is an anuran amphibian species now used as model in vertebrate comparative genomics. It provides the same advantages as <it>Xenopus laevis </it>but is diploid and has a smaller genome of 1.7 Gbp. Therefore <it>X. tropicalis </it>is more amenable to systematic transcriptome surveys. We initiated a large-scale partial cDNA sequencing project to provide a functional genomics resource on genes expressed in the nervous system during early embryogenesis and metamorphosis in <it>X. tropicalis</it>.</p> <p>Results</p> <p>A gene index was defined and analysed after the collection of over 48,785 high quality sequences. These partial cDNA sequences were obtained from an embryonic head and retina library (30,272 sequences) and from a metamorphic brain and spinal cord library (27,602 sequences). These ESTs are estimated to represent 9,693 transcripts derived from an estimated 6,000 genes. Comparison of these cDNA sequences with protein databases indicates that 46% contain their start codon. Further annotation included Gene Ontology functional classification, InterPro domain analysis, alternative splicing and non-coding RNA identification. Gene expression profiles were derived from EST counts and used to define transcripts specific to metamorphic stages of development. Moreover, these ESTs allowed identification of a set of 225 polymorphic microsatellites that can be used as genetic markers.</p> <p>Conclusion</p> <p>These cDNA sequences permit <it>in silico </it>cloning of numerous genes and will facilitate studies aimed at deciphering the roles of cognate genes expressed in the nervous system during neural development and metamorphosis. The genomic resources developed to study <it>X. tropicalis </it>biology will accelerate exploration of amphibian physiology and genetics. In particular, the model will facilitate analysis of key questions related to anuran embryogenesis and metamorphosis and its associated regulatory processes.</p

Caractérisation des transposons à ADN Tc1-mariner chez le xénope et utilisation du transposon Sleeping Beauty comme vecteur de transgenèse germinale

LES ELEMENTS DE TYPE TC1 (TLES) ET LES ÉLÉMENTS DE TYPE MARINER APPARTIENNENT A LA SUPERFAMILLE DES TRANSPOSONS À ADN TC1-MARINER QUI SONT TRÈS LARGEMENT RÉPANDUS DANS LE RÈGNE VIVANT. GRÂCE AUX DONNÉES DE RESSOURCES GÉNOMIQUES COMBINÉES À UNE STRATÉGIE DE PCR DÉGÉNÉRÉE, NOUS AVONS IDENTIFIÉ SIX LIGNÉES DE TLES PRÉSENTS DANS LE GÉNOME DE L'AMPHIBIEN XENOPUS TROPICALIS. LA PLUPART DE CES LIGNÉES APPELÉES EAGLE, FROGGY, XEMINOS, XTTXR ET JUMPY PRÉSENTE DES CARACTÉRISTIQUES TYPIQUES DES ÉLÉMENTS TLES: UN CADRE DE LECTURE CODANT UNE TRANSPOSASE DE 340-350 ACIDES AMINÉS, ENCADRÉ PAR DES SÉQUENCES RÉPÉTÉES INVERSÉES. POUR CHACUNE DE CES LIGNÉES, NOUS AVONS IDENTIFIÉ DES COPIES CONTENANT UN CADRE DE LECTURE DE LA TRANSPOSASE INTACT SUGGÉRANT QUE CES ÉLÉMENTS POURRAIENT ÊTRE ENCORE ACTIFS. L'ANALYSE PHYLOGÉNÉTIQUE MONTRE QUE CES TLES SONT RELIÉS À DES TLES D'ACTINOPTERIGIENS ET D'AMPHIBIENS DANS UN DEUXIÈME TEMPS, NOUS AVONS IDENTIFIÉ LE PREMIER MLE, XTMAR1, ISOLÉ D'UN GÉNOME DE VERTÉBRÉ À SANG-FROID XENOPUS TROPICALIS. L'ANALYSE PHYLOGÉNÉTIQUE INCLUANT DES REPRÉSENTANTS DES DIFFÉRENTES SOUS-FAMILLES DE MLES RÉVÈLE QUE XTMAR1 EST RELIÉ AU MLE HUMAIN HSMAR2, DANS UNE DEUXIÈME LIGNÉE DE LA SOUS-FAMILLE IRRITANS. EN DERNIÈRE PARTIE, NOUS AVONS UTILISÉ LE TARNSPOSON TC1-MARINER SLEEPING BEAUTY (SB) COMME VECTEUR DE TRANSGENÈSE GERMINALE CHEZ LE XÉNOPE. CETTE TECHNIQUE REPOSE SUR LA MICROINJECTION. DANS UN EMBRYON DE XÉNOPE AU STADE UNE CELLULE, DE LA TRANSPOSASE SB ET D'UN PSEUDO-TRANSPOSON CONTENANT LE MARQUEUR FLUORESCENT GFP. DANS DES CONDITIONS OPTIMISÉES, NOUS OBTENONS UN NOMBRE IMPORTANT D'INDIVIDUS DEMI-TRANSGÉNIQUES.MARINER-LIKE ELEMENTS (MLES) AND TC1-LIKE ELEMENTS (TLES) BELONG TO THE TC1-MARINER SUPERFAMILY OF DNA TRANSPOSONS WHICH IS VERY WIDESPREAD IN ANIMALS GENOMES WE HAVE USED GENOMIC SEQUENCING DATA FROM THE FIRST ASSEMBLY OF THE AMPHIBIAN XENOPUS TROPICALIS GENOME TO IDENTIFY MULTIPLE LINEAGES OF TLES FULL-LENGTH ELEMENTS WERE ISOLATED IN EACH LINEAGE AND WERE CHARACTERIZED. MOST OF THEM EXHIBIT THE TYPICAL CHARACTERITICS OF TC1-LIKE ELEMENT THESE NEW TLES WERE NAMED EAGLE, FROGGY, JUMPY, MAYA, XEMINOS, XTTXR. PHYLOGENETICQUE STUDY INDICATE THAT THEIR CLOSEST RELATIVES ARE PRESENT IN THE GENOMES OF ACTINOPTERYGIAN AND AMPHIBIAN. WE HAVE IDENTIFIED FOR MOST OF THESE TLES, COPIES CONTAINING AN INTACT TRANSPOSASE OPEN READING FRAME SUGGESTING THAT THESE ELEMENTS MAY BE STILL ACTIVE. IN ADDITION, WE HAVE IDENTIFIED THE FIRST COMPLETE MARINER-LIKE ELEMENT, XTMAR1, WITHIN THE GENOME OF A POIKILOTHERM VERTEBRATE, XENOPUS TROPICALIS. THE PHYLOGENETIC ANALYSIS OF THE RELATIONSHIPS BETWEEN MLE TRANSPOSASES REVEALS THAT XTMAR1 IS CLOSELY RELATED TO THE HUMAN MARINER HSMAR2 AND THAT TOGTHER THEY FORM A SECOND DISTINCT LINEAGE OF THE IRRITANS SUBFAMILY. FINALLY, WE TESTED THE SLEEPING BEAUTY TRANSPOSON SYSTEM FOR ITS SUITABILITY AS A GENETIC VECTOR FOR THE GENERATION OF TRANSGENIC XENOPUS LAEVIS WE CONDUCTED A TRANSGENESIS STUDY BASED ON THE CO-INJECTION INTO ONE-CELL STAGE EMBRYOS OF THE SB TRANSPOSASE RNA AND A GFP-REPORTER PSEUDO-TRANSPOSON. THE OPTIMAL CONDITIONS LEAD US TO THE OBTENTION OF HALF TRANSGENIC ANIMALS AND A NUMBER OF SOMATIC CELL CLONES.ORSAY-PARIS 11-BU Sciences (914712101) / SudocSudocFranceF

Xenopus tropicalis, nouveau modèle d étude de maladies génétiques humaines

ORSAY-PARIS 11-BU Sciences (914712101) / SudocSudocFranceF

Évaluation de la chimiorésistance de Plasmodium falciparum à différents antipaludiques (chloroquine, sulfadoxine-pyriméthamine, quinine) et profil génétique des isolats correspondants

Depuis la notification en 1986 des premiers cas de résistance de P. falciparum en Côte d'Ivoire, relativement peu d'études ont été consacrées à l'évaluation de la chimio-résistance dans ce pays. Il nous a paru nécessaire de mettre en place un système de surveillance de la résistance de P. falciparum aux antipaludiques au moyen des tests d'efficacité thérapeutique à la chloroquine (CQ) et à la sulfadoxine-pyriméthamine (SP), in vitro à la chloroquine, la pyriméthamine et la quinine. Une approche plus fondamentale basée sur la PCR, la RFLP à l'aide d'endonucléases spécifiques et du séquençage des fragments d'ADN des gènes dhfr, dhps, pfmdr 1 de chaque isolat de P. falciparum ont été réalisées. Les résultats de l'efficacité thérapeutique ont révélé 21,7 % d'échecs thérapeutiques précoces (ETP), 3,6 % d'échecs cliniques tardifs et 19,3 % d'échecs parasitologiques tardifs contre 55,4 % de réponses cliniques et parasitologiques adéquates (RCPA) à la chloroquine. 36,2 % des isolats mis en culture étaient chloroquino-résistants (CQ-R). Quant à la sulfadoxine-pyriméthamine, 23,6 % d'échecs thérapeutiques (ET) et 76,4 % de réponses cliniques adéquates ont été observés. 39 % des isolats testés in vitro étaient hautement résistants à la pyriméthamine (PYR). Par contre, aucun isolat quinino-résistant n'a été mis en évidence dans cette étude. L'analyse du polymorphisme de taille des fragments d'ADN des isolats de P. falciparum a révélé 100 % d'isolats K76T chez les enfants ayant un ET à chloroquine et 71,4 % d'isolats K76T au sein des isolats CQ-R. Cependant, 11,8 % des enfants ayant une RCPA portaient des isolats pfcrt mutants. Les mutations affectant les gènes dhfr et dhps ont concerné respectivement 26,4 % et 93,4 % des isolats étudiés. Si les isolats dhfr mutants étaient portés par 85,7 % des enfants ayant un ETP, les mutants dhps étaient présents chez 100 % de ces enfants. De plus, 85,4 % de ces isolats dhfr mutants étaient hautement résistants à la PYR. En définitive, ces résultats reposent le problème de l'utilisation de la CQ et de la SP comme médicament de première et de deuxième intention en Côte d'Ivoire en général et à Abidjan en particulier. Ils peuvent servir de base de données au programme national de lutte contre le paludisme dans le pays pour une meilleure utilisation et une rationalisation des antipaludiques usuels.Since the notification in 1986 of the first cases of P. falciparum resistance in Côte d'Ivoire, relatively few studies have been devoted to the assessment of chemio-resistance in the country. It appeared necessary to us to set up a monitoring system of the resistance of P. falciparum to antimalarial drugs by means of the tests of therapeutic efficacy to chloroquine (CQ) and sulfadoxine-pyrimethamine (SP), in vitro to chloroquine, pyrimethamine and quinine. A more fundamental approach based on the PCR, the RFLP using specific endonucleases and the sequencing of DNA fragments of dhfr, dhps, pfmdr-1 genes of P. falciparum isolates have been achieved. The results of the therapeutic efficacy revealed 21.7% of early therapeutic failures (ETF), 3.6% of late clinical failures (LCF) and 19.3% of late parasitological failures (LPF) against 55.4% of adequate clinical and parasitological responses (ACPR) to chloroquine. 36.2% of the isolates were chloroquino-resistant (CQ-R). As for the sulfadoxine-pyriméthamine, 23.6% of therapeutic failures (TF) and 76.4% of adequate clinical and parasitological responses were observed. 39% of the isolates tested in vitro were highly resistant to pyrimethamine (PYR). On the other hand, no quinino-resistant isolate was highlighted in this study. The analysis of the polymorphism of size of P. falciparum DNA fragments revealed 100% of isolates K76T in the children having therapeutic failures to chloroquine and 71.4% of isolates K76T within the CQ-R isolates. However, 11.8% of the children having ACPR carried pfcrt mutant isolates. The changes affecting the dhfr and dhps genes concerned respectively 26.4% and 93.4% of the studied isolates. If the mutant dhfr isolates were carried by 85.7% of the children having ETF, the mutants dhps were present at 100% of these children. Moreover, 85.4% of these dhfr mutant isolates were highly resistant to the PYR. Ultimately, these results rest the problem of the use of the chloroquine and the sulfadoxine-pyrimethamine as first and second line drug in Côte.d'Ivoire in general and in Abidjan in particular. These results can also be used as a basis of data for the National Program of Fight against Malaria in the country for a better use and a rationalization of usual antimalarial drugs.PARIS12-CRETEIL BU Multidisc. (940282102) / SudocSudocFranceF

Recherche de nouveaux antipaludiques actifs sur les souches sauvages et résistantes de Plasmodium vivax et Plasmodium falciparum

La culture in vitro de P. vivax étant difficile à réaliser, les gènes dhfr de P. vivax sensible à la pyriméthamine (Ser58Ser117), le double mutant (Ser58Arg+Ser117Asn) et le triple mutant résistant à la pyriméthamine (Ser58Arg+Ser117Asn+Ile173Leu) ont été exprimés dans la levure mutée Saccharomyces cerevisiae pour l'expression de son gène dhfr chromosomique. Les gènes dhfr humain et de levure ont aussi été testés à titre de contrôle de l'activité inhibitrice spécifique des antifoliniques sur les DHFRs de P. vivax. La levure mutante ainsi transformée a permis de sélectionner 6 antifoliniques parmi les 25 inhibant spécifiquement les transformants exprimant les gènes dhfr de P. vivax en se référant à la pyriméthamine et au MTX. La concentration inhibitrice à 50% (CI50) des 6 drogues a été déterminée sur des isolats de P. falciparum. Le séquençage des gènes dhfr des isolats confirme la corrélation qui existe entre le génotype dhfr des isolats et la réponse in vitro au test de chimiosensibilité.Au cours de ce travail, le sulfanilamide, utilisé pour augmenter la pénétration des drogues dans la levure, a montré une inhibition sélective des transformants exprimant les gènes de dhfr de Plasmodium. Cette inhibition confirmait le fait suggéré par d'autres laboratoires que les sulfamides, famille à laquelle appartient le sulfanilamide, ont une deuxième cible qui la DHFR. Ainsi, la découverte de cette nouvelle action du sulfanilamide ou de son dérivé le sulfa-DHP pourrait permettre le développement et l'exploitation d'une nouvelle classe d'antifoliniques utiles pour le traitement des maladies parasitaires tel le paludisme.In this study, because Plasmodium vivax cannot be cultured in vivo, we used a DHFR-deficient yeast strain expressing heterologous P. vivax dhfr gene for the screening of 25 antifolate derivatives to evaluate promising antifolate drugs. DHFR inhibitors function mainly as a competitive inhibitor of the parasite enzyme. This yeast mutant strain was transformed with plasmids containing either a P. vivax dhfr gene wild-type (S58+S117+I173), or the double (S58R+S117N) or triple mutant (S58R+S117N+I173L) and as controls the human and the own yeast dhfr gene. Pyrimethamine and methotrexate were used as control drugs. The screening allow us to select 6 of 25 compounds, that selectively inhibit both P. vivax wild-type and mutant DHFR enzymes in vivo in yeast. The inhibitory concentration (IC50) of these 6 quinazoline compounds derivatives were determined on in vitro cultures of P. falciparum field isolates. The sequenced dhfr gene of isolates confirms that a correlation exists between the dhfr genotype and the biomolecular answer to the in vitro drugs response.Unexpected, sulfanilamide knowed as a competitive inhibitor of pABA, showed a selective inhibition on transformants expressing P. vivax dhfr genes, suggesting that the DHFR is a second target of sulfa-drug or its derivative sulfa-DHP. Forthermore, the hypersensitivity of P. vivax DHFR triple mutant and double mutant enzymes to sulfanilamide or sulfa-DHP points to the specificity of sulfa-DHP analogs as an alternative treatment to pyrimethamine resistant DHFR. This discovery could lead to the development of the chemical synthesis of new DHFR inhibitors, useful for the treatment of malaria or other infection diseases.ORSAY-PARIS 11-BU Sciences (914712101) / SudocSudocFranceF

Early aspects of gonadal sex differentiation in Xenopus tropicalis with reference to an antero-posterior gradient.

International audienceIn an effort to contribute to the development of Xenopus tropicalis as an amphibian model system, we carried out a detailed histological analysis of the process of gonadal sex differentiation and were able to find evidence that gonadal differentiation in X. tropicalis follows an antero-posterior gradient. Although the main reason for the presence of a gradient of sex differentiation is still unknown, this gradient enabled us to define the early events that signal ovarian and testicular differentiation and to identify the undifferentiated gonad structure. Given the various advantages of this emerging model, our work paves the way for experiments that should contribute to our understanding of the dynamics and mechanisms of gonadal sex differentiation in amphibians. J. Exp. Zool. 309A, 2008. (c) 2008 Wiley-Liss, Inc

Regulation of XSnail2 expression by Rho GTPases.

International audienceWe analyzed the effects of Rho GTPases on XSnail2 expression during neural crest (NC) ontogeny in Xenopus laevis embryos. The ectopic expression of both dominant-negative (N-) and constitutively active (V-) Rho GTPase mutants after RNA or DNA microinjection disrupted the endogenous expression of XSnail2, XFoxD3, and XSnail1. V14RhoA and N17Rac1 were inhibitory, whereas N19RhoA and V12Rac1 increased NC marker gene expression. In reporter assays using a XSnail2 promoter-green fluorescent protein (GFP) construct (alpha700BA-GFP), the ectopic expression of V14RhoA, N17Rac1, or the Rac1 inhibitor NSC 23766 decreased reporter expression in NC-neural plate, whereas N19RhoA or the RhoA inhibitor Y27632 and V12Rac1 enhanced it. Similarly, transgenic embryos expressing Rho GTPase mutants and GFP under control of the alpha700BA promoter displayed variations similar to those observed for ectopic RNA and DNA expression. These results show that Rho GTPases can regulate the expression of XSnail2 during NC ontogeny

Reduced levels of survival motor neuron protein leads to aberrant motoneuron growth in a Xenopus model of muscular atrophy.

International audienceSpinal muscular atrophy (SMA) is a neurodegenerative disease characterized by motor neuron loss and skeletal muscle atrophy. The loss of function of the smn1 gene, the main supplier of survival motor neuron protein (SMN) protein in human, leads to reduced levels of SMN and eventually to SMA. Here, we ask if the amphibian Xenopus tropicalis can be a good model system to study SMA. Inhibition of the production of SMN using antisense morpholinos leads to caudal muscular atrophy in tadpoles. Of note, early developmental patterning of muscles and motor neurons is unaffected in this system as well as acetylcholine receptors clustering. Muscular atrophy seems to rather result from aberrant pathfinding and growth arrest and/or shortening of motor axons. This event occurs in the absence of neuronal cell bodies apoptosis, a process comparable to that of amyotrophic lateral sclerosis. Xenopus tropicalis is revealed as a complementary animal model for the study of SMA