Untersuchungen zur O-GlcNAc Modifikation von Plasmodium falciparum dem Erreger der Malaria tropica

Hintergrund: Malaria tropica ist global gesehen eine der tödlichsten Infektionskrankheiten. In einem historischen Kraftakt gelang es, die durch den Parasiten Plasmodium falciparum ausgelöste und über Mosquitos übertratgene Krankheit einzudämmen und in vielen Ländern vollständig zu eradizieren. Dieses Ziel global zu erreichen, scheint jedoch noch in weiter Ferne. Vor allen in den tropischen Regionen Afrikas versterben jährlich weiterhin mehrere hunderttausend Menschen, vor allem Säuglinge und Kinder, an der Krankheit. Posttranslationale Modifikationen (PTMs) bilden eine große Gruppe biochemischer Veränderungen, welche die Komplexität von Proteomen aller Lebewesen erhöhen. PTMs wurden aufgrund ihrer Beteiligung an verschiedensten Zellprozessen bereits mehrfach als Ziel potentieller Malaria-Therapeutika diskutiert. O-GlcNAcylierung ist eine bei vielen Organismen verbreitete PTM. Diese spezielle Form der Glykosylierung ist aufgrund der Beteiligung an verschiedenen Pathologien wie neurodegenerativen Erkrankungen und Neoplasien in den Fokus gerückt. Sie spielt jedoch auch eine wichtige regulative Rolle im zellulären Energiestoffwechsel. Auch bei P. falciparum ist ihr allgemeines Vorkommen bereits bekannt. Ziel dieser Arbeit war es zu identifizieren, welche Proteine im Proteom des Parasiten O-GlcNAc modifiziert sind, mehr über den Prozess dieser Modifikation herauszufinden und eventuelle Funktionen bei Apikomplexa generell nachvollziehen zu können. Methoden: Der P. falciparum Stamm 3D7 wurde in Erythrozytenkulturen angezüchtet und vermehrt. Das Proteom wurde auf O-GlcNAcylierung untersucht, hierbei wurden unterschiedliche Nachweismethoden angewandt. Das Niveau der UDP-GlcNAc-Konzentration, dem Donor der O-GlcNAc-Modifikation, wurde in der high performance Anion Exchange Chromatography] (HPAEC) gemessen. O-GlcNAcylierte Proteine wurden nach click-chemistry-Biotinmarkierung und mit Weizenkeimlektin-Agaroseperlen angereichert. Die Identifizierung der modifizierten Proteine erfolgte in der Massenspektometrie (nano-LC MS/MS). Ergebnisse: P. falciparum verfügt über einen eigenen, wenn auch im Vergleich zu MRC-5 Kontrollzellen sehr niedrigen, UDP-GlcNAc-Vorrat. In der Immundetektion stellen sich Unterschiede der O-GlcNAcylierung der verschiedenen Parasitenstadien dar. Durch verschiedene proteomischeTechniken konnten im Proteom von reifen Trophozoiten 14 O-GlcNAcylierte Proteine eindeutig identifiziert werden (11 über click-chemistry, 6 über sWGA-Perlen Anreicherung und eine durch spezifische Antikörper). Diese Proteine sind an für das Überleben des Parasiten wichtigen, Funktionen, Strukturen und Stoffwechselwegen beteiligt. Vier der identifizierten Proteine sind Enzyme der Glykolyse. Diese ist von großer Bedeutung für den Energiestoffwechsel des Parasiten. Durch Inkubation click-chemistry-modifizierter Proteine mit spezifischen Antikörpern konnte die O-GlcNAcyirung der Proteine Hsp70 und α-Tubulin zusätzlich zur Massenspektroskopie immunbiochemisch gezeigt werden. Die Inkubation von P. falciparum-Kulturen mit einem Inhibitor der O-GlcNAc-Abspaltung führte zu einer nicht signifikanten Abnahme der Wachstumsrate Schlussfolgerungen: In dieser Studie konnten zum ersten Mal O-GlcNAcylierte Proteine im Proteom von P. falciparum nachgewiesen und benannt werden. Auch wenn einige Parallelen zum O-GlcNAcom anderer Organismen bestehen, lassen strukturelle Unterschiede doch die Möglichkeit erscheinen, diese Strukturen als mögliche Ziele einer Malariatherapie in Angriff zu nehmen. Die Blockierung der UDP-GlcNAc Biosynthese oder der Abspaltung von O-GlcNAc von bereits modifizierten Proteinen könnten andere vielversprechende Ansätze darstellen, um den Lebenszyklus von P. falciparum zu hemmen. Zudem können das Auftreten der posttranslationalen Modifikation bei P. falciparum sowie die Unterschiede im Vergleich zu anderen Spezies Hinweise bezüglich der taxonomischen Einordnung der Apicomplexa bieten

Identification of O-GlcNAcylated proteins in Plasmodium falciparum

Abstract Background Post-translational modifications (PTMs) constitute a huge group of chemical modifications increasing the complexity of the proteomes of living beings. PTMs have been discussed as potential anti-malarial drug targets due to their involvement in many cell processes. O-GlcNAcylation is a widespread PTM found in different organisms including Plasmodium falciparum. The aim of this study was to identify O-GlcNAcylated proteins of P. falciparum, to learn more about the modification process and to understand its eventual functions in the Apicomplexans. Methods The P. falciparum strain 3D7 was amplified in erythrocytes and purified. The proteome was checked for O-GlcNAcylation using different methods. The level of UDP-GlcNAc, the donor of the sugar moiety for O-GlcNAcylation processes, was measured using high-pH anion exchange chromatography. O-GlcNAcylated proteins were enriched and purified utilizing either click chemistry labelling or adsorption on succinyl-wheat germ agglutinin beads. Proteins were then identified by mass-spectrometry (nano-LC MS/MS). Results While low when compared to MRC5 control cells, P. falciparum disposes of its own pool of UDP-GlcNAc. By using proteomics methods, 13 O-GlcNAcylated proteins were unambiguously identified (11 by click-chemistry and 6 by sWGA-beads enrichment; 4 being identified by the 2 approaches) in late trophozoites. These proteins are all part of pathways, functions and structures important for the parasite survival. By probing clicked-proteins with specific antibodies, Hsp70 and α-tubulin were identified as P. falciparum O-GlcNAc-bearing proteins. Conclusions This study is the first report on the identity of P. falciparum O-GlcNAcylated proteins. While the parasite O-GlcNAcome seems close to those of other species, the structural differences exhibited by the proteomes provides a glimpse of innovative therapeutic paths to fight malaria. Blocking biosynthesis of UDP-GlcNAc in the parasites is another promising option to reduce Plasmodium life cycle

Apart From Rhoptries, Identification of Toxoplasma gondii's O-GlcNAcylated Proteins Reinforces the Universality of the O-GlcNAcome

International audienceO-linked β-N-acetylglucosaminylation or O-GlcNAcylation is a widespread post-translational modification that belongs to the large and heterogeneous group of glycosylations. The functions managed by O-GlcNAcylation are diverse and include regulation of transcription, replication, protein's fate, trafficking, and signaling. More and more evidences tend to show that deregulations in the homeostasis of O-GlcNAcylation are involved in the etiology of metabolic diseases, cancers and neuropathologies. O-GlcNAc transferase or OGT is the enzyme that transfers the N-acetylglucosamine residue onto target proteins confined within the cytosolic and nuclear compartments. A form of OGT was predicted for Toxoplasma and recently we were the first to show evidence of O-GlcNAcylation in the apicomplexans Toxoplasma gondii and Plasmodium falciparum. Numerous studies have explored the O-GlcNAcome in a wide variety of biological models but very few focus on protists. In the present work, we used enrichment on sWGA-beads and immunopurification to identify putative O-GlcNAcylated proteins in Toxoplasma gondii. Many of the proteins found to be O-GlcNAcylated were originally described in higher eukaryotes and participate in cell shape organization, response to stress, protein synthesis and metabolism. In a more original way, our proteomic analyses, confirmed by sWGA-enrichment and click-chemistry, revealed that rhoptries, proteins necessary for invasion, are glycosylated. Together, these data show that regardless of proteins strictly specific to organisms, O-GlcNAcylated proteins are rather similar among living beings