ヌクレオチド除去修復のバックアップ機構に関する研究

金沢大学医薬保健研究域薬学系我々は、紫外線誘発DNA損傷であるシクロブタン型ピリミジン二量体や(6-4)光産物を特異的に認識するモノクローナル抗体を作製し、1J/m^2という正常ヒト細胞の生存率に影響を与えない紫外線線量域におけるDNA損傷修復能を測定できる超高感度定量系を開発した。その結果、従来の線量域(10-40J/m^2)では全く修復能が見られなかった色素性乾皮症A群(XP-A)患者由来細胞XP12BE、およびXP-G患者由来細胞XP2BIにおいて、(6-4)光産物が24時間で約40-50%修復されるという現象を見出した。本研究では、この現象がヌクレオチド除去修復が完全に破壊されたときのバックアップシステムによるものか否かさらに検証した。そこで、臨床症状と修復欠損がより重篤なXPEMB-1(XP-A)細胞、およびXPCS2LV(コケイン症候群併発型XP-G)細胞について1J/m^2照射後の(6-4)光産物の修復動態を解析したところ、これらの細胞ではウェスタンブロッティングで各欠損タンパク質が全く検出できなかったが、やはり24時問で20-40%程度の修復が観察された。また、検出限界以下の変異型タンパク質の存在とそれによる残存活性を否定するため、XPAあるいはXPGのノックアウトマウス由来細胞の供与を受けて同様の解析を行った結果、色素性乾皮症患者由来細胞で見られるよりも程度は低いものの(6-4)光産物の修復傾向が確認された。以上の結果より、1J/m^2照射時に見られるヌクレオチド除去修復欠損細胞における(6-4)光産物の修復能は、ヌクレオチド除去修復以外のバックアップシステムによる可能性が示唆された。研究課題/領域番号:14658159, 研究期間(年度):2002出典：「ヌクレオチド除去修復のバックアップ機構に関する研究」研究成果報告書　課題番号14658159（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（ https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-14658159/）を加工して作

ヌクレオチド除去修復反応の細胞内調節機構に関する研究

金沢大学自然科学研究科我々はこれまでDDB (DDB1/DDB2ヘテロダイマー)がヌクレオチド除去修復の促進因子として働くことを示してきたが、最近このDDBがユビキチン・プロテアソーム系にも関与することが示されており、本研究でもヌクレオチド修復の調節や修復以外におけるDDBの機能に視野を広げて解析を行った。具体的には、作製したDDB1特異的モノクローナル抗体を用いてDDB1の細胞内局在性を調べるとともに、DDB1とDDB2を各々ドキシサイクリン存在下で過剰発現する細胞株を樹立し、各サブユニットを過剰発現させたときの細胞への影響を検討した。その結果、抗DDB1モノクローナル抗体による免疫染色像は、主に細胞質に局在するという従来の過剰発現細胞を用いた報告とは異なり、核内でドット状の局在を示した。また、この染色像はDDB2遺伝子に変異をもつXP-E細胞、およびDDB2の発現が抑制されているチャイニーズハムスター細胞でも観察されることからDDB2に非依存的であることがわかり、他の因子の関与が考えられた。また、核の一部に局所紫外線照射を行うとこのドットはDNA損傷部位に集積し、この反応はDDB2に依存していた。一方、DDB1を過剰発現させた細胞ではドット状の染色像は見られず、多くは細胞質のみが強く均質に染色された。興味深いことに、このDDB1過剰発現細胞株は増殖能やコロニー形成能に著しい抑制が見られ、一部の細胞ではアポトーシス誘導が観察された。さらに、ヌクレオチド除去修復能には顕著な影響は認められなかったが、過剰発現時に細胞内のc-Jun量が顕著に増加し、またリン酸化体も増加していることがわかった。以上の結果より、DDB1がc-Junの活性調節およびアポトーシスにも関与する可能性が示唆された。研究課題/領域番号:13555218, 研究期間(年度):2001-2012出典：研究課題「ヌクレオチド除去修復反応の細胞内調節機構に関する研究」課題番号12143202（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-12143202/）を加工して作

除去修復エンドヌクレアーゼの機能とその欠損による分子病態に関する研究

金沢大学医薬保健研究域薬学系ヌクレオチド除去修復(NER)において、XPGとXPF-ERCC1はそれぞれ損傷の3′側と5′側の切断酵素として働くが、XPGやERCC1をノックアウトしたマウスはいづれも成長阻害、離乳前死亡というNER欠損だけでは説明できない重篤な症状を示す。また、XPGはXPF-ERCC1による5′側切断にも関与している可能性が示唆されており、本研究ではXPGの除去修復エンドヌクレアーゼとしての機能以外の役割に注目した。1. Two-hybridシステムを用いた解析より、XPGとERCC1の相互作用が示唆された。プルダウンアッセイを用いて試験管内で確認したところ、バキュロウィルス高発現系から精製されたリコンビナントタンパクや試験管内転写/翻訳反応により合成されたタンパクで両者の相互作用が確認できた。また、その相互作用ドメインのマッピングを行い、XPGはN末とC末の2箇所(主にN末)にERCC1はN末の領域に特定できた。本研究で示されたXPGとERCC1との相互作用は、XPF-ERCC1の損傷部位へのリクルートに関与しているのかもしれない。2. XPGタンパクはNERとは別の修復機構である塩基除去修復(BER)にも関与する可能性が示唆されており、この点について検討した。まず、ウラシルを1個のみ含むDNA基質を用いて塩基除去修復の試験管内切断反応系を確立した。これを用いて各種細胞粗抽出液の切断活性を比較したところ、XP-G患者由来細胞や放医研の塩見らによって樹立されたxpgノックアウトマウス由来細胞の抽出液は、正常細胞に比べて常に低い切断活性(50-80%)を示すことがわかった。また、この低切断活性はウラシルDNAグリコシラーゼの反応効率の低下に起因していた。しかし、リコンビナントXPGを反応系に添加しても相補されず、XPGの塩基除去修復への関与は間接的なものであることが示唆された。研究課題/領域番号:10165206, 研究期間(年度):1998出典：「除去修復エンドヌクレアーゼの機能とその欠損による分子病態に関する研究」研究成果報告書　課題番号10165206（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-10165206/)を加工して作

遺伝子の傷と発がん:がんは予防できるか？

年月日：2004年8月28日（土）午後1時～2時30分, 場所：金沢大学サテライト・プラザ：寺井町立図書

DNA修復関連因子を利用したDNA損傷検出系の開発

金沢大学薬学部1)リコンビナント修復関連因子の調製と各因子に対するモノクローナル抗体の作製当初、本研究で使用する修復関連因子としてDNA末端に結合するKu抗原、ミスマッチ塩基対に結合するMutS、バブルやループ構造に特異的に切断を入れるXPGやXPF-ERCCI等を想定したが、今年度はXPG,XPF-ERCC1に加えて、ヌクレオチド除去修復のDNA損傷結合因子であるXPA、XPC-hHR23Bをリコンビナントタンパクとして調製した(MutSは市販)。XPA以外は全てバキュロウィルス/昆虫細胞高発現系を利用し、XPA、XPF、ERCC1にはヒスチジン(His)のタグを付けた。一方、各因子に対するモノクローナル抗体は、抗XPGと抗ERCC1抗体(2種ずつ)を昨年度までに、抗XPA(3種)と抗XPC(1種)抗体を今年度新たに樹立した(抗His抗体は市販)。2)キャピラリー電気泳動法を用いたDNA損傷検出系の開発本研究では、修復関連因子とそれらに対する特異抗体、ならびにキャピラリー電気泳動装置を利用したDNA損傷検出系の開発を目指した。そこでまず、これまでに作製したシクロブタン型ピリミジン二量体に対するTDM-2モノクローナル抗体を利用して条件設定を試みた。紫外線(0-10J/m^2)を照射された細胞から抽出したDNA(熱変性したもの)をTDM-2抗体、Alexa^488で標識された抗マウスIgG(H+L)2次抗体と反応させた後、ノンコテーィリングシリカキャピラリーで分離した。488nmのアルゴンイオンレーザーで2次抗体の蛍光を検出したところ、DNA-TDM-2抗体-2次抗体の複合体に由来すると思われるピークが検出され、その面積は紫外線線量に依存して増加した。本年度は抗体を用いた予備実験しかできなかったが、キャピラリー電気泳動法を用いてDNA損傷を検出できる見通しが立ったため、今後は調製した各種修復関連因子と抗体を利用することにより、様々なDNA損傷の検出系へと応用していく予定である。研究課題/領域番号:11878091, 研究期間(年度):1999出典：研究課題「DNA修復関連因子を利用したDNA損傷検出系の開発」課題番号11878091（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-11878091/）を加工して作

除去修復エンドヌクレアーゼ機能とその欠損による原子病態の生化学的解析

金沢大学薬学部XPGとXPE-ERCC1タンパクは、ヌクレオチド除去修復(NER)機構においてそれぞれ3′,5′切断酵素として働くが、本来はバブルやループなどの特殊なDNA構造を基質とするエンドヌクレアーゼである。これらの遺伝子(XPGあるいはERCC1)を欠損したマウスはいづれも成長阻害を示し、離乳前にすべて死亡する。本研究では、この両エンドヌクレアーゼのNER機構以外での機能に着目し、その本体を明らかにすることを目的とした。本年度の主な研究成果は以下のとおりである。1.バキュロウィルス/昆虫細胞系を用いてXPGタンパクを高発現させ、3種のカラムステップにより精製した。様々なDNA基質を用いて切断活性を調べたところ、1-3ntのバブル(塩基ミスマッチ)型DNA基質に対しても切断活性を示すことが明らかとなった。また、3ntのループ(IDミスマッチ)型DNA基質に対する切断活性も認められ、酵素活性的にはDNA中に生じたミスマッチ部分に対してXPGが働き得る可能性が示唆された。2.放医研の塩見らによって樹立されたxpgノックアウトマウス胎児由来細胞を継代培養したところ、最初は正常あるいはヘテロ細胞より増殖率が低かったものの、途中から急激に増殖率が上昇し、正常やヘテロ由来細胞よりも早く株化した。4継代ごとに細胞よりDNAを抽出して、マイクロサテライト解析を行ったところ、調べた8種類のプライマーのうち2種類で継代に伴ったバンドパターンの変化が観察された。3.酵母のTwo-hybridシステムを用いてXPGタンパクと相互作用する可能性のある4つのクローンを分離した。現在、塩基配列の決定、ならびに各相互作用についてのin vitroでの確認を行っている。4.MBP-XPG、あるいはMBP-ERCC1を抗原としてマウスに免疫を行い、これまでにXPGタンパクに対するモノクローナル抗体を4種類樹立した。研究課題/領域番号:09269207, 研究期間(年度):1997出典：研究課題「除去修復エンドヌクレアーゼ機能とその欠損による原子病態の生化学的解析 」課題番号09269207（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-09269207/）を加工して作

ヒト細胞におけるヌクレオチド除去修復のバックアップ機構に関する研究

我々は近年、紫外線誘発DNA損傷のシクロブタン型ピリミジンダイマーや(6-4)光産物を超高感度に検出定量する系を開発し、(6-4)光産物に対するヌクレオチド除去修復欠損をバックアップする機構の存在を示唆してきた。本研究では、その実体を明らかにすることを目的として以下の解析を行った。1)完全欠損型ノックアウトマウス由来細胞を用いて1J/m^2の紫外線照射後の(6-4)光産物の修復動態を調べたところ、24時間後に30-50%の(6-4)光産物が消失し、CPDについても程度は低いものの有意な消失が認められた(48時間で20-30%)。2)日本人XP-A患者に多い変異であるAlwNI型変異をもつXPA cDNAをHeLa細胞に導入して安定発現する形質転換細胞を得たところ、ベクターのみを導入したコントロール細胞と同じ修復能を示したことから、この変異型XPAタンパク質はドミナントネガティブ効果がないことがわかった。3)シクロブタン型ピリミジンダイマーの検出感度をさらに10倍上昇させることに成功し、健常人由来細胞で100%、XP-A細胞でも90%程度が生存できる0.1J/m^2という紫外線照射後の修復動態をXP2BI細胞(XP-G)で調べたところ、シクロブタン型ピリミジンダイマーの時間依存的な消失がより顕著になり、新規のDNA修復機構が(6-4)光産物と同様にシクロブタン型ピリミジンダイマーに対しても働きうることが示唆された。4)適応応答についても検討を行ったが、前日に極低線量(0.2J/m^2)を照射しておくことで1J/m^2照射後の修復効率にわずかな亢進が見られたものの、適応応答の存在を確信するには至らなかった。以上の結果より、(1)この修復活性はヌクレオチド除去修復の残存活性ではなく別の機構によること、(2)この機構はヒトのみならずマウスにも存在すること、(3)修復効率はヌクレオチド除去修復と同様にシクロブタン型ピリミジンダイマーより(6-4)光産物の方が効率的であること、(4)この経路には少なくともXPAおよびXPGは関与しないことが明らかとなった。We have established a super-sensitive detection method for measuring cyclobutane pyrimidine dimers (CPDs) and (6-4)photoproducts (6-4PPs) induced by biological doses of ultraviolet (UV) light and suggested that human cells might have a novel repair system mainly for 6-4PPs other than nucleotide excision repair which has been thought to be only repair system for those lesions in humans so far. In this study, we have obtained the following findings.1.The removal of 6-4PPs was observed even in the embryonic fibroblasts derived from xpa(-/-) or xpg(-/-) knock-out mice (30-50% after 24 hr). In addition, the removal of CPDs was also detected in those cells with a less efficiency (20-30% after 48 hr).2.HeLa cells stably expressing AlwNI-type mutant XPA did not show any impairment of nucleotide excision repair activity, suggesting that this mutant XPA protein does not have a dominant-negative effect.3.We have further sensitized the detection method for CPDs, enabling us to determine the repair kinetics of CPDs in cells exposed to non-killing doses of Was low as 0.1 J/m^2. Under this condition, we have found that xeroderma pimentosum cells significantly remove CPDs (〜40% after 48hr).4.We could observe some weak enhancement of repair efficiency after UV irradiation of 1 J/m^2 when the human cells had been pie-exposed to 0.2 J/m^2. However, we need more extensive experiments to conclude whether the back-up repair system is under the control of adaptive responses.Taken together with those results, we concluded that mammalian cells have a certain back-up repair system, independent of XPA and XPG, which removes mainly 6-4PP but also CPDs with a less efficiency.研究課題/領域番号:15310036, 研究期間(年度):2003-2004出典：「ヒト細胞におけるヌクレオチド除去修復のバックアップ機構に関する研究」研究成果報告書　課題番号15310036 (KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）)　　　本文データは著者版報告書より作

ヌクレオチド除去修復反応を調節する細胞内因子の解析

金沢大学薬学部近年、高度に精製されたタンパクを用いてヌクレオチド除去修復(NER)反応が試験管内で再構成された。単純化した試験管内系の特徴を生かして基本的NER反応の詳細な作用機構を解明していく一方で、細胞内における他のDNA代謝機構との共存・協調のメカニズムや細胞内の様々なネットワークの中で働くための調節機構を明らかにする必要がある。本研究では、NER機構と相互作用し、基本的NER反応を正、あるいは負に調節する細胞内因子を同定・単離することを目的とした。本年度はまずアッセイ系の確立、および材料の調製を試みた。1.NERの試験管内アッセイ系をスクリーニング系として用いるために、^P標識を必要としない非RIの簡便なアッセイシステムの開発を試みた。蛍光物質をDNA損傷と見立て特定部位に導入した基質DNAを用いることによって、RIで標識することなく損傷を直接蛍光で追跡することが可能となった。また、作製した基質DNAは長期保存が可能となり、再現性の高い系として期待される。問題点として、RIを使用した場合に比べて検出感度が劣ることが挙げられるが、現在基質DNAのデザインの改善などいくつかの改良を行っている。2.再構成系の確立のために、種々のNER因子をリコンビナントタンパクとして調製する必要があり、各遺伝子をバキュロウィルス/昆虫細胞発現用ベクターにサブクローニングし、最終的にリコンビナントウィルスを得た。現在までにXPG、XPA、XPF-ERCC1、およびXPC-hHR23Bが得られ、XPGはすでにリコンビナントタンパクとして精製された。3.各NER因子に対するモノクローナル抗体の樹立を目指し、まずMBP-XPG融合タンパクを免疫原としてマウスを免疫し、XPGに対するモノクローナル抗体4種を作製した。またERCC1とXPFに対するモノクローナル抗体の作製も現在進行している。研究課題/領域番号:09253215, 研究期間(年度):1997出典：研究課題「ヌクレオチド除去修復反応を調節する細胞内因子の解析 」課題番号09253215（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-09253215/）を加工して作

A New Disorder in UV-Induced Skin Cancer with Defective DNA Repair Distinct from Xeroderma Pigmentosum or Cockayne Syndrome

We report the characterization of a Japanese woman who exhibited many freckles and skin cancers in sun-exposed areas, but displayed no photosensitivity. Fibroblasts (KPSX7) derived from this patient showed similar UV sensitivity to that of normal human fibroblasts. The KPSX7 cells showed normal levels of unscheduled DNA synthesis, recovery of RNA synthesis, recovery of replicative DNA synthesis, protein-binding ability to UV-damaged DNA, and post-translational modification of xeroderma pigmentosum (XP) C. These results indicate that the patient had neither XP nor Cockayne syndrome. Although these results suggest that the KPSX7 cells were proficient in nucleotide excision repair activity, host-cell reactivation (HCR) activity of KPSX7 cells was reduced. Furthermore, introduction of UV damage endonuclease into the cells restored repair activity in the HCR assay to almost normal levels. These results indicate that KPSX7 cells are defective for some types of repair activity in UV-damaged DNA. In summary, the patient had a previously unknown disorder related to UV-induced carcinogenesis, with defective DNA repair