Calcium-Dependent Persistent Facilitation of Spike Backpropagation in the CA1 Pyramidal Neurons

Sodium-dependent action potentials initiated near the soma are known to backpropagate over the dendrites of CA1 pyramidal neurons in an activity-dependent manner. Consequently, later spikes in a train have smaller amplitude when recorded in the apical dendrites. We found that depolarization and resultant Ca²⁺ influx into dendrites caused a persistent facilitation of spike backpropagation. Dendritic patch recordings were made from CA1 pyramidal neurons in mouse hippocampal slices under blockade of fast excitatory and inhibitory synaptic inputs. Trains of 10 backpropagating action potentials induced by antidromic stimulation showed a clear decrement in the amplitude of later spikes when recorded in the middle apical dendrites. After several depolarizing current pulses, the amplitude of later spikes increased persistently, and all spikes in a train became almost equal in size. BAPTA (10 mM) contained in the pipette or low-Ca^(2+) perfusing solution abolished this depolarization-induced facilitation, indicating that Ca²⁺ influx is required. This facilitation was present in Gα_q knock-out mice that lack the previously reported muscarinic receptor-mediated enhancement of spike backpropagation. Therefore, these two forms of facilitation are clearly distinct in their intracellular mechanisms. Intracellular injection of either calmodulin binding domain (100 μM) or Ca²⁺/calmodulin-kinase II (CaMKII) inhibitor 281–301 (10 μM) blocked the depolarization-induced facilitation. Bath application of a membrane-permeable CaMKII inhibitor KN-93 (10 μM) also blocked the facilitation, but KN-92 (10 μM), an inactive isomer of KN-93, had no effect. These results suggest that increases in [Ca²⁺)]_i cause persistent facilitation of spike backpropagation in the apical dendrite of CA1 pyramidal neuron by CaMKII-dependent mechanisms

脳の神経回路の機能解明

東京大学 / 大阪大学 / 金沢大学医薬保健研究域医学系脳の神経回路の機能解明を目指す特定領域研究(領域番号020)の総括班として、研究方針の決定、研究項目の策定、研究の評価と情報発信などを行った。研究組織はA01:神経回路の形成、A02:神経回路の機能的成熟、A03:神経回路の特異的機能発現、の3項目から成り、12名の計画研究班員と、5年間で79名の公募研究班員から構成した。これらの班員の間で極めて活発に連携や共同研究がおこなわれた。5年間に、班員からNature, Science, Cell, Neuronなどの一流国際学術誌に900編を超える論文が発表された。また、新聞報道をはじめとして研究成果の一般への発信も盛んに行われた。This project aimed at supervising the research group that was organized to elucidate neural network function in the brain (Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas-020-from MEXT). The research of the group consists of the following three categories ; A01 : formation of neural circuits, A02 : functional maturation of neural circuits, A03 : specific functions of neural circuits. The group consists of 12 core designated scientists and overall 79 researchers who were selected through peer review of their research proposals. Many collaborations and interactions among the members have been carried out. During the 5 years\u27 research, more than 900 papers have been published in high rank journals including Nature, Science, Cell, and Neuron. Moreover, a number of research outcomes became known to the public through newspapers and magazines.研究課題/領域番号:16069101, 研究期間(年度):2004-201

人工神経回路を用いた小脳シナプス淘汰の研究

金沢大学医学部本研究では培養系において単離小脳プルキンエ細胞に対するシナプス形成過程のリアルタイム分析を目指している。第1段階として、マウス・プルキンエ細胞の単離培養系の開発を行い、さらに培養プルキンエ細胞の発達過程を分析した。小脳ニューロンに最適化した無血清培地(Furuya et al.,1998)を用い、さらに播種密度などの諸条件を系統的に検討した結果、従来難しかったマウス胎児由来単離小脳プルキンエ細胞の長期(1ヶ月以上)培養が可能となった。また、この方法により培養したプルキンエ細胞では樹状突起形態や電気的興奮特性の発達が生体内での生後発達と良く似た時間推移で進行し、所期の実験遂行に適当であることが分かった。第2段階として、上記の培養系に下オリーブ核ニューロンをの共培養する技術を開発した。2〜3日前に準備しておいた小脳ニューロン培養系の上に妊娠16日齢マウス胎児由来の下オリーブ核スライスを貼付することにより、登上線維を数百ミクロンにわたって出芽・伸展させることに成功した。また共培養開始直前にgene gunを用いて蛍光色素DiIを付着させた金属微粒子を下オリーブ・スライスに打ち込む技術も開発した。この技術により、生きたままの状態で登上線維を効率良く標識できるようになった。さらにDiI標識像をレーザー共焦点顕微鏡で5〜10分毎に観察することにより、登上線維の伸展の様子を24時間以上にわたりリアルタイムで観察することに成功した。現在、第3段階として、GFP遺伝子を導入し自家蛍光を発するようにしたプルキンエ細胞を単離培養系の材料として用い、DiI標識登上線維のGFP標識プルキンエ細胞に対する神経支配過程のリアルタイム分析を進めている。なお、培養法に関する成果はJournal of Neuroscience Methods (Tabata et al.,104:45-53,2000)に発表した。また、培養法の応用に関する論文をProc.Natl.Acad.Sci.USA.(Furuya et al.,97:11528-11533,2000)に発表し、Journal of Neuroscienceにも投稿中である。研究課題/領域番号:11878162, 研究期間(年度):1999 – 2000出典：研究課題「人工神経回路を用いた小脳シナプス淘汰の研究」課題番号11878162（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-11878162/）を加工して作

シナプスにおける逆行性伝達物質としての内因性カンナビノイドの作用機構と生理的意義

金沢大学医薬保健研究域医学系マリファナの活性成分であるΔ9-テトラヒドロカンナビノールは、中枢神経系に広く分布するCB1カンナビノイド受容体を介して作用を発現する。CB1受容体に対する内因性のリガンド(内因性カンナビノイド、以下eCBと略す)の候補として、アナンダミドと2-アラキドノイルグリセロールがある。CB1は中枢ニューロンのシナプス前線維に局在し、その活性化によって伝達物質放出の減少が起こる。しかし、本研究開始時点で、eCBがどのような刺激によって生成され、どのような生理機能を果たすかという最も重要な点についてはほとんど明らかにされていなかった。本研究では、eCBのシナプス伝達における役割を主として電気生理学的手法を用いて調べ、以下の結果を得た。海馬神経細胞および小脳プルキンエ細胞において、シナプス後細胞の脱分極と細胞内Ca^濃度上昇によりeCBが放出され、逆行性に抑制性および興奮性シナプス終末のCB1受容体に作用して伝達物質放出の一過性減少がおこることを明らかにした。また、グループI代謝型グルタミン酸受容体や、M_1及びM_3ムスカリニックアセチルコリン受容体などのGq結合型受容体の活性化によってeCB放出が起こり、逆行性にCB1受容体に作用して伝達物質放出の一過性減少がおこることを発見した。さらに、海馬培養細胞において、単独ではeCB放出を起こさない程度の弱いM_1/M_3受容体の活性化と弱い脱分極を同時に与えると、eCBが効率よく産生された。これは、海馬神経細胞に存在するフォスフォリパーゼCβ1(PLCβ1)の酵素活性が、M_1/M_3受容体の活性化と細胞内Ca^の両方に依存することが原因である。したがって、PLCβ1はコリナージック入力(シナプス前活動)と細胞内Ca^濃度上昇(シナプス後神経活動)の同期性検出分子として機能することが明らかになった。The active component of marijuana (Δ^9-tetrahydrocannabinol) exerts various psychomotor actions through binding to the CB1 cannabinoid receptor that is distributed widely in the central nervous system. Two candidates for endogenous cannabinoid (eCB) (i.e.,endogenous ligands for the CB1 receptor) are anandamide and 2-arachidonoylglycerol. The CB1 receptor is present at presynaptic sites of central neurons and the binding of cannabinoids to this receptor results in reduction of neurotransmitter release from presynaptic terminals. However, at the beginning of the present research project, it was largely unknown what stimuli to neurons could produce eCBs and what roles eCBs played in brain functions. We have examined roles of eCBs in modulation of synaptic transmission by using electrophysiological methods and have obtained the following results.In hippocampal neurons and cerebellar Purkinje cells, depolarization and resultant elevation of intracellular Ca^ concentration causes production of eCBs that retrogradely activates presynapric CB1 receptors and induces transient suppression of neurotransmitter release. Activation of Gq-coupled receptors including group I metabotropic glutamate receptors and M_1/M_3 muscarinic acetylcholine receptors also induces eCB-mediated rretrograde suppression of neurotransmitter release. Furthermore, we have found that, in cutured hippocampal neurons, weak depolarization and mild activation of M_1/M_3 muscarinic acetylcholine receptors effectively induce eCB-mediated retrograde suppression, whereas either stimulus alone causes no detectable suppression. We have disclosed that this synergism is attributable to the property of phospholipase Css1 (PLCss1) that is activated by a subunit of Gq/11 and also sensitive to physiological range of intracellular Ca^. Therefore, PLCss1 can function as a coincidence detector of cholinergic afferent activity (i.e.,presynaptic activity) and postsynaptic depolarization.研究課題/領域番号:13854028, 研究期間(年度):2001-200

発達脳におけるシナプス除去と機能成熟に関与するシグナル伝達系

金沢大学大学院・医学系研究科本研究では、発達期小脳でみられる登上線維シナプス除去と機能成熟の分子機構を解明することを目標とし、種々の自然発生ミュータントマウスおよび遺伝子改変マウスの解析を行ってきた。本年度は、高閾値型のP/Qタイプカルシウムチャネルを形成するα1Aサブユニットのノックアウトマウス(α1A-/-)と、抑制性伝達物質のGABA合成酵素GAD67のノックアウトマウスと野生型マウスとのヘテロマウス(GAD67+/-)を調べた。生後3〜4週目のα1A-/-では、80%以上のプルキンエ細胞が複数の登上線維による多重支配を受けていることが電気生理学的及び形態学的解析の結果明らかになった。生後1日目からの発達の様子を電気生理学的に詳細に解析した結果、α1A-/-では、生後10日までの過剰な登上線維シナプス除去(前期シナプス除去過程)が著しく障害されていることが判明した。一方、生後10日から16日の間の除去(後期シナプス除去過程)は正常におこった。これから、P/Qタイプカルシウムチャネルを介するプルキンエ細胞へのカルシウム流入が、前期シナプス除去過程に必須であり、後期シナプス除去過程には別の機構が関与することが示唆された。GAD67+/-では、成熟しても多重登上線維支配を受けるプルキンエ細胞の割合が野生型マウスに比べて明らかに高いという予備的結果を得た。このGAD67+/-の生後1日目からの発達を電気生理学的および形態学的に詳細に解析するとともに、もうひとつのGABA合成酵素であるGAD65のノックアウトマウスを調べ、登上線維シナプス除去と機能成熟に対する抑制性シナプス入力の役割を明らかにするのが今後の課題である。研究課題/領域番号:13555218, 研究期間(年度):2001-2013出典：研究課題「発達脳におけるシナプス除去と機能成熟に関与するシグナル伝達系」課題番号12053226（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-12053226/）を加工して作

小脳特異的な低域値型カルシウムチャネルノックアウトマウスの作製と機能解析

金沢大学医薬保健研究域医学系本研究では、低閾値型カルシウムチャネルα1Gの小脳機能における役割を明らかにするため、α1G遺伝子コンディショナルノックアウトマウスの作製を目的としている。昨年度、相同組み換えを生じた2種のES細胞クローンを用いて、キメラマウスの作製を行ったが、どのクローン由来のキメラマウスも生殖系列へのES細胞伝達を示さなかった。今年度は、昨年作製したターゲッティングベクターの相同組み換え領域を2kb延長して、再度ES細胞で相同組み換え体をクローニングした。その結果、おおよそ1%の確率で相同組み替えを生じたES細胞がクローニングできた。クローニングしたES細胞を用いて、マウス胚盤胞へのインジェクションを行ったところ、現在、ES細胞の寄与率の高いキメラマウスが誕生している。今後はこのキメラマウスを野生型マウスと交配してヘテロマウスを作製する予定である。さらに、小脳プルキンエ細胞特異的にα1G遺伝子を欠損させるため、プルキンエ細胞特異的にCre組み換え酵素を発現するトランスジェニックマウスのベクターの作製も行った。今後は、このベクターを用いてトランスジェニックマウスを作出し、上記のヘテロマウスと交配させる予定である。さらにα1Gサブユニット特異的な力価の高い抗体が存在しないため、α1G細胞内ループ領域を抗原タンパクとして大腸菌で合成し、ウサギを用いてポリクローナル抗体の作製を行った。作製し精製した抗体は、Western blot法により小脳抽出物中のα1Gサブユニットだと考えられる260kDaのバンドを特異的に認識した。今後は、ノックアウトマウスの解析に有効に使いたいと考えている。研究課題/領域番号:13878165, 研究期間(年度):2001 – 200

発達期小脳における登上線維シナプス除去の臨界期と神経活動依存症に関する研究

金沢大学医薬保健研究域医学系成熟動物では小脳プルキンエ細胞はただ1本の登上線維によって支配されるが、発達初期には3〜5本の登上線維の支配を受ける。発達につれて過剰な登上線維が淘汰され、生後約20日で成熟型の1対1の結合が完成する。先行研究から、NMDA受容体の関与が示唆されていたが、この過程が神経活動に依存するかについての直接的な証明がなく、また、小脳生後発達のどの時期に必要であるか(臨界期)については明らかでなかったので、本研究においてこの2点を追求した。(1) 神経活動依存性の検討:テトロドトキシン(TTX)をethylene-vinylacetate copolymer(ELVAX)に溶媒によって混合し、その微小ブロックを生後10日の発達期マウス小脳の表面に移植して、これからTTXを持続的に小脳に与えた。マウスを成長させ、生後24日から36日の間に、登上線維の支配様式を電気生理学的に解析した。ELVAX近傍の小脳6-8葉で記録すると、vehicle投与群に対してTTX投与群では、登上線維による多重支配を受けるプルキンエ細胞の割合が有意に高かった。これに対し、ELVAXから離れた小脳1/2および10葉では、両群間で有意差はなかった。したがって、TTXの効果は小脳内に限局しており、小脳内の神経活動が登上線維シナプス排除に必要であると考えられた。(2) 臨界期の検討:NMDA受容体の特異的阻害剤のMK-801(0.25μg/g体重)を1日1回生後7日から14日まで8日間腹腔内投与し、その後投与をやめて生後25日まで成長させた群(P7-P14投与群)、生後15日から21日まで7日間腹腔内投与した群(P15-P21投与群)および生理食塩水投与対照群で比較したところ、P15-P21投与群でのみ登上線維シナプス排除に異常を認めた。この結果は、登上線維シナプス排除の臨界期は生後15日以降であることを示す。研究課題/領域番号:10156237, 研究期間(年度):1998出典：「発達期小脳における登上線維シナプス除去の臨界期と神経活動依存症に関する研究」研究成果報告書　課題番号10156237（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-10156237/)を加工して作

Heterosynaptic expression of depolarization-induced suppression of inhibition (DSI) in rat hippocampal cultures

金沢大学大学院医学系研究科保健学専攻Depolarization-induced suppression of inhibition (DSI) is a transient suppression of the inhibitory synaptic transmission, observed in the hippocampus and the cerebellum, upon postsynaptic depolarization. Using rat hippocampal cultures, we examined whether DSI is confined to the inhibitory synapses on the depolarized neuron or, if DSI can spread to those on neighboring non-depolarized neurons. Whole-cell recordings were performed in 108 neuronal pairs with the following synaptic responses. Stimulation of one neuron evoked the inhibitory autaptic currents (IACs) recurrently in that neuron and also elicited the inhibitory postsynaptic currents (IPSCs) orthodromically in the other neuron. In 38 of 108 pairs, the postsynaptic depolarization caused transient suppression of IPSCs (homosynaptic DSI). In 11 of the 38 pairs exhibiting the homosynaptic DSI, the depolarization also induced suppression of IACs (heterosynaptic DSI). The heterosynaptic DSI, like the homosynaptic DSI, depended on depolarizing pulse duration and was blocked by a phorbol ester. These results suggest that DSI can spread to the synapses on a neighboring non-depolarized neuron in rat hippocampal cultures

Ca2+-assisted receptor-driven endocannabinoid release: mechanisms that associate presynaptic and postsynaptic activities

金沢大学大学院医学系研究科機能障害学Endogenous cannabinoids (endocannabinoids) serve as retrograde messengers at synapses in various regions of the brain. They are released from postsynaptic neurons and cause transient and long-lasting reduction of neurotransmitter release through activation of presynaptic cannabinoid receptors. Endocannabinoid release is induced either by increased postsynaptic Ca2+ levels or by activation of Gq/11-coupled receptors. When these two stimuli coincide, endocannabinoid release is markedly enhanced, which is attributed to the Ca2+ dependency of phospholipase Cβ (PLCβ). This Ca2+-assisted receptor-driven endocannabinoid release is suggested to participate in various forms of synaptic plasticity, including short-term associative plasticity in the cerebellum and spike-timing-dependent long-term depression in the somatosensory cortex. In these forms of plasticity, PLCβ seems to function as a coincident detector of presynaptic and postsynaptic activities. © 2007 Elsevier Ltd. All rights reserved

Presynaptic monoacylglycerol lipase activity determines basal endocannabinoid tone and terminates retrograde endocannabinoid signaling in the hippocampus

金沢大学大学院医学系研究科機能障害学Endocannabinoids function as retrograde messengers and modulate synaptic transmission through presynaptic cannabinoid CB1 receptors. The magnitude and time course of endocannabinoid signaling are thought to depend on the balance between the production and degradation of endocannabinoids. The major endocannabinoid 2-arachidonoylglycerol (2-AG) is hydrolyzed by monoacylglycerol lipase (MGL), which is shown to be localized at axon terminals. In the present study, we investigated how MGL regulates endocannabinoid signaling and influences synaptic transmission in the hippocampus. We found that MGL inhibitors, methyl arachidonoyl fluorophosphonate and arachidonoyl trifluoromethylketone, caused a gradual suppression of cannabinoid-sensitive IPSCs in cultured hippocampal neurons. This suppression was reversed by blocking CB1 receptors and was attenuated by inhibiting 2-AG synthesis, indicating that MGL scavenges constitutively released 2-AG. We also found that the MGL inhibitors significantly prolonged the suppression of both IPSCs and EPSCs induced by exogenous 2-AG and depolarization-induced suppression of inhibition/excitation, a phenomenon known to be mediated by retrograde endocannabinoid signaling. In contrast, inhibitors of other endocannabinoid hydrolyzing enzymes, fatty acid amide hydrolase and cyclooxygenase-2, had no effect on the 2-AG-induced IPSC suppression. These results strongly suggest that presynaptic MGL not only hydrolyzes 2-AG released from activated postsynaptic neurons but also contributes to degradation of constitutively produced 2-AG and prevention of its accumulation around presynaptic terminals. Thus, the MGL activity determines basal endocannabinoid tone and terminates retrograde endocannabinoid signaling in the hippocampus. Copyright © 2007 Society for Neuroscience