Differential effects of cyclic and constant stress on ATP release and mucociliary transport by human airway epithelia: Role of cyclic stress in airway mucociliary transport

In the lungs, the first line of defence against bacterial infection is the thin layer of airway surface liquid (ASL) lining the airway surface. The superficial airway epithelium exhibits complex regulatory pathways that blend ion transport to adjust ASL volume to maintain proper mucociliary clearance (MCC). We hypothesized that stresses generated by airflow and transmural pressures during breathing govern ASL volume by regulating the rate of epithelial ATP release. Luminal ATP, via interactions with apical membrane P2-purinoceptors, regulates the balance of active ion secretion versus absorption to maintain ASL volume at optimal levels for MCC. In this study we tested the hypothesis that cyclic compressive stress (CCS), mimicking normal tidal breathing, regulates ASL volume in airway epithelia. Polarized tracheobronchial epithelial cultures from normal and cystic fibrosis (CF) subjects responded to a range of CCS by increasing the rate of ATP release. In normal airway epithelia, the CCS-induced increase in ASL ATP concentration was sufficient to induce purinoceptor-mediated increases in ASL height and MCC, via inhibition of epithelial Na+-channel-mediated Na+ absorption and stimulation of Cl− secretion through CFTR and the Ca2+-activated chloride channels. In contrast, static, non-oscillatory stress did not stimulate ATP release, ion transport or MCC, emphasizing the importance of rhythmic mechanical stress for airway defence. In CF airway cultures, which exhibit basal ASL depletion, CCS was partially effective, producing less ASL volume secretion than in normal cultures, but a level sufficient to restore MCC. The present data suggest that CCS may (1) regulate ASL volume in the normal lung and (2) improve clearance in the lungs of CF patients, potentially explaining the beneficial role of exercise in lung defence

Human Airway Ecto-adenylate Kinase: A MECHANISM TO PROPAGATE ATP SIGNALING ON AIRWAY SURFACES

Mechanically induced ATP release from human airway epithelial cells regulates mucociliary clearance through cell surface nucleotide receptors. Ectoenzymes detected on these cells were recently shown to terminate ATP-mediated responses by sequential dephosphorylation of extracellular ATP into ADP, AMP, and adenosine. We now demonstrate that an ecto-adenylate kinase (ecto-AK) contributes to the metabolism of adenine nucleotides on human airway epithelial surfaces by the reversible reaction: ATP + AMP 2ADP. This phosphotransferase exhibited a bilateral distribution on polarized primary cultures of human bronchial epithelial cells with a 4-fold higher activity on the mucosal surface. Ecto-AK presented an absolute requirement for magnesium and adenine-based nucleotides. UMP, GMP, and CMP could not substitute for AMP as gamma-phosphate acceptor, and UDP could not replace ADP. Apparent K(m) and V(max) values were 23 +/- 5 microM and 1.1 +/- 0.1 nmol x min(-1) x cm(-2) for ATP and 43 +/- 6 microM and 0.5 +/- 0.1 nmol x min(-1) x cm(-2) for ADP. Ecto-AK accounted for 20% of [gamma-(32)P]ATP dephosphorylation, and the impermeant AK inhibitor, diadenosine pentaphosphate, reduced ADPase activity by more than 70% on both epithelial surfaces. Time course experiments on ATP metabolism demonstrated that ecto-AK significantly prolongs effective ATP and ADP concentrations on airway epithelial surfaces for P2 receptor signaling and reduces by 6-fold adenosine production. Our data suggest a role for this nucleotide entrapment cycle in the propagation of purine-mediated mucociliary clearance on human airway epithelial surfaces

Metabolism of P2 Receptor Agonists in Human Airways: IMPLICATIONS FOR MUCOCILIARY CLEARANCE AND CYSTIC FIBROSIS

Extracellular nucleotides are among the most potent mediators of mucociliary clearance (MCC) in human lungs. However, clinical trials revealed that aerosolized nucleotides provide only a transient improvement of MCC to patients diagnosed with cystic fibrosis (CF). In this study, we identified the mechanism that eliminates extracellular nucleotides from human airways. Polarized primary cultures of human bronchial epithelial cells were impermeable to extracellular nucleotides but rapidly dephosphorylated ATP into ADP, AMP, and adenosine. The half-life of a therapeutic ATP concentration (0.1 mm) was approximately 20 s within the periciliary liquid layer. The mucosal epithelial surface eliminated P2 receptor agonists (ATP = UTP > ADP > UDP) at 3-fold higher rates than the serosal surface. We also showed that mucosal (not serosal) ectoATPase activity increases toward areas most susceptible to airway obstruction (nose < bronchi << bronchioles). Bronchial cultures from patients with CF, primary ciliary dyskinesia, or alpha1-antitrypsin deficiency exhibited 3-fold higher mucosal (not serosal) ectoATPase activity than normal cultures. Time course experiments indicated that CF enhances ATP elimination and adenosine accumulation on the mucosal surface. Furthermore, nonspecific alkaline phosphatase was identified as the major regulator of airway nucleotide concentrations in CF, primary ciliary dyskinesia, and alpha1-antitrypsin deficiency. The ectoAT-Pase activity and mRNA expression of mucosally restricted nonspecific alkaline phosphatase were 3-fold higher on bronchial cultures from these patients than from healthy subjects. This study demonstrates that the duration of nucleotide-mediated MCC is limited by epithelial ectonucleotidases throughout human airways, with the efficiency of this mechanism enhanced in chronic inflammatory lung diseases, including CF

Ecto 5′-Nucleotidase and Nonspecific Alkaline Phosphatase: TWO AMP-HYDROLYZING ECTOENZYMES WITH DISTINCT ROLES IN HUMAN AIRWAYS

In human airways, extracellular adenosine regulates epithelial functions supporting mucociliary clearance, an important airway defense mechanism against bacterial infection. Thus, defining the mechanisms of adenosine generation is critical for elucidating the role of this nucleoside in airway homeostasis. In this study, we identified the source of adenosine on the mucosal surface of human airway epithelia. Polarized primary cultures of human nasal or bronchial epithelial cells were assayed for transepithelial transport, cytosolic and cell surface adenosine production. Ussing chamber experiments indicated that serosal 1 microM [(3)H]adenosine was not transported to the mucosal compartment. Messenger RNA for the cytosolic AMP-specific 5'-nucleotidase (CN-I) was not detected in human bronchial epithelial cells, suggesting that mucosal adenosine did not originate from intracellular pools. In contrast, extracellular 0.1 mm ATP was rapidly dephosphorylated into adenosine on the mucosal epithelial surface. We identified two ectonucleotidases that mediated the conversion of AMP to adenosine: ecto 5'-nucleotidase (ecto 5'-NT, CD73) and alkaline phosphatase (AP). Both mucosal and serosal epithelial surfaces displayed ecto 5'-NT activity (K(m) = 14 microM, V(max) = 0.5 nmol x min(-1) x cm(-2)), whereas AP activity was restricted to the mucosal surface (K(m,)(high) = 36 microM, V(max) = 1.2 nmol x min(-1) x cm(-2); K(m,)(low) = 717 microM, V(max) = 2.8 nmol x min(-1) x cm(-2)). In bronchial cultures and tissues, ecto 5'-NT accounted for >80% of total activity toward 0.01 mm AMP, compared with <15% for 5 mm AMP. The proximal airway AP isoform was identified as nonspecific AP (NS AP) by levamisole sensitivity and mRNA expression. The two ectoenzymes presented opposite airway distributions, ecto 5'-NT and NS AP mRNA dominating in higher and lower airways, respectively. Collectively, these experiments support a major role for extracellular nucleotide catalysis and for ecto 5'-NT and NS AP in the regulation of adenosine concentrations on airway surfaces

Mathematical Model of Nucleotide Regulation on Airway Epithelia: IMPLICATIONS FOR AIRWAY HOMEOSTASIS

In the airways, adenine nucleotides support a complex signaling network mediating host defenses. Released by the epithelium into the airway surface liquid (ASL) layer, they regulate mucus clearance through P2 (ATP) receptors, and following surface metabolism through P1 (adenosine; Ado) receptors. The complexity of ASL nucleotide regulation provides an ideal subject for biochemical network modeling. A mathematical model was developed to integrate nucleotide release, the ectoenzymes supporting the dephosphorylation of ATP into Ado, Ado deamination into inosine (Ino), and nucleoside uptake. The model also includes ecto-adenylate kinase activity and feed-forward inhibition of Ado production by ATP and ADP. The parameters were optimized by fitting the model to experimental data for the steady-state and transient concentration profiles generated by adding ATP to polarized primary cultures of human bronchial epithelial (HBE) cells. The model captures major aspects of ATP and Ado regulation, including their >4-fold increase in concentration induced by mechanical stress mimicking normal breathing. The model also confirmed the independence of steady-state nucleotide concentrations on the ASL volume, an important regulator of airway clearance. An interactive approach between simulations and assays revealed that feed-forward inhibition is mediated by selective inhibition of ecto-5′-nucleotidase. Importantly, the model identifies ecto-adenylate kinase as a key regulator of ASL ATP and proposes novel strategies for the treatment of airway diseases characterized by impaired nucleotide-mediated clearance. These new insights into the biochemical processes supporting ASL nucleotide regulation illustrate the potential of this mathematical model for fundamental and clinical research

E-NTPDases in human airways: Regulation and relevance for chronic lung diseases

Chronic obstructive lung diseases are characterized by the inability to prevent bacterial infection and a gradual loss of lung function caused by recurrent inflammatory responses. In the past decade, numerous studies have demonstrated the importance of nucleotide-mediated bacterial clearance. Their interaction with P2 receptors on airway epithelia provides a rapid ‘on-and-off’ signal stimulating mucus secretion, cilia beating activity and surface hydration. On the other hand, abnormally high ATP levels resulting from damaged epithelia and bacterial lysis may cause lung edema and exacerbate inflammatory responses. Airway ATP concentrations are regulated by ecto nucleoside triphosphate diphosphohydrolases (E-NTPDases) which are expressed on the mucosal surface and catalyze the sequential dephosphorylation of nucleoside triphosphates to nucleoside monophosphates (ATP → ADP → AMP). The common bacterial product, Pseudomonas aeruginosa lipopolysaccharide (LPS), induces an acute reduction in azide-sensitive E-NTPDase activities, followed by a sustained increase in activity as well as NTPDase 1 and NTPDase 3 expression. Accordingly, chronic lung diseases, including cystic fibrosis (CF) and primary ciliary dyskinesia, are characterized by higher rates of nucleotide elimination, azide-sensitive E-NTPDase activities and expression. This review integrates the biphasic regulation of airway E-NTPDases with the function of purine signaling in lung diseases. During acute insults, a transient reduction in E-NTPDase activities may be beneficial to stimulate ATP-mediated bacterial clearance. In chronic lung diseases, elevating E-NTPDase activities may represent an attempt to prevent P2 receptor desensitization and nucleotide-mediated lung damage

Normal and Cystic Fibrosis Airway Surface Liquid Homeostasis: THE EFFECTS OF PHASIC SHEAR STRESS AND VIRAL INFECTIONS

Mammalian airways normally regulate the volume of a thin liquid layer, the periciliary liquid (PCL), to facilitate the mucus clearance component of lung defense. Studies under standard (static) culture conditions revealed that normal airway epithelia possess an adenosine-regulated pathway that blends Na+ absorption and Cl− secretion to optimize PCL volume. In cystic fibrosis (CF), the absence of CF transmembrane conductance regulator results in a failure of adenosine regulation of PCL volume, which is predicted to initiate mucus stasis and infection. However, under conditions that mimic the phasic motion of the lung in vivo, ATP release into PCL was increased, CF ion transport was rebalanced, and PCL volume was restored to levels adequate for lung defense. This ATP signaling system was vulnerable, however, to insults that trigger CF bacterial infections, such as viral (respiratory syncitial virus) infections, which up-regulated extracellular ATPase activity and abolished motion-dependent ATP regulation of CF PCL height. These studies demonstrate (i) how the normal coordination of opposing ion transport pathways to maintain PCL volume is disrupted in CF, (ii) the hitherto unknown role of phasic motion in regulating key aspects of normal and CF innate airways defense, and (iii) that maneuvers directed at increasing motion-induced nucleotide release may be therapeutic in CF patients

Caractérisation des vésicules intralamellaires des chloroplastes de Lemna Minor L

Ce travail consiste à caractériser les vésicules intralamellaires des chloroplastes de Lemna minor L. L'objectif principal est d'identifier les constituants biochimiques des vésicules intralamellaires (VI) afin de comparer leur composition à celle des systèmes membranaires avoisinants et à celle des plastoglobules retrouvés dans le stroma. Les classes de composés rapportés dans les VI sont les lipides, les protéines, les pigments et les prénylquinones. La méthode d'extraction et le degré de pureté des fractions de vésicules intralamellaires avaient déjà été évalués de façon qualitative en microscopie électronique. Des analyses biochimiques de la composition lipidique de la fraction de vésicules intralamellaires après une et deux purifications confirment la pureté de la fraction. Les lipides ont été analysés par chromatographie sur couche mince de silice G et par chromatographie en phase gazeuse. Des électrophorèses SDS-PAGE dénaturantes et non-dénaturantes nous ont permis de séparer les complexes photosynthétiques et les protéines. Les pigments et les prénylquinones ont été séparés et purifiés par chromatographie sur couche mince de silice et quantifiés respectivement à l'aide de leur spectre d'absorption dans la lumière visible et dans l'ultraviolet. Ces analyses étaient effectuées sur les vésicules intralamellaires et sur les membranes photosynthétiques des chloroplastes de la L. minor, à l'exception des lipides des membranes photosynthétiques. Ces dernières ont déjà été faites par Laroche (1983). Les résultats et les principales conclusions se résument comme ceci: La composition biochimique des vésicules intralamellaires des frondes de L. minor est différente de celle des plastoglobules. En plus des lipides neutres et des prénylquinones qui sont les principaux constituants des plastoglobules, les VI contiennent des lipides polaires (DGG, DDG, PL et SL), des pigments et des protéines. En général, la composition en lipides polaires des vésicules intralamellaires est semblable à celle des membranes thylacoïdiennes et de la membrane interne de l'enveloppe. Les pigments sont présents dans des proportions semblables dans les membranes photosynthétiques et les vésicules intralamellaires. La composition en prénylquinones des vésicules intralamellaires est formée d'un mélange de quinone membranaires et de leurs précurseurs. Les vésicules intralamellaires contiennent tous les complexes photosynthétiques rencontrés dans les membranes photosynthétiques. Le gel dénaturant démontre que les deux fractions ont plusieurs protéines en commun. Contrairement aux membranes photosynthétiques, la bande protéique de 32 kD est la deuxième bande la plus importante dans les VI, la première étant de 28 kD. De plus, une protéine de 47 kD est localisée uniquement dans les thylacoïdes et une protéine de 31 kD se retrouve uniquement dans les VI. Nous constatons que la vésicule intralamellaire contient tous les éléments biochimiques permettant de supposer la présence d'une membrane à sa périphérie, une membrane dont la composition serait comparable à celle des membranes photosynthétiques. D'un point de vue ontogénique, nous proposons que les vésicules intralamellaires soient formées à partir de la membrane interne de l'enveloppe et qu'elles participent à l'élaboration des membranes photosynthétiques. Certains constituants des vésicules intralamellaires se lieraient à l'extrémité des thylacoïdes et une partie de leur contenu riche en lipides neutres et en quinones serait libéré dans le stroma sous forme de plastoglobules

Caractérisation des ATP-diphosphohydrolases du système respiratoire des mammifères

La détérioration des structures en béton armé a pris une ampleur sans précédent durant les trois dernières décennies. Cette détérioration est majoritairement reliée à la corrosion de l'armature d'acier. Les barres d'armature en matériaux composites renforcées de fibres (PRF), récemment introduites sur le marché, constituent une alternative très sérieuse en remplacement des barres d'acier conventionnelles dès que se présentent des conditions de corrosion. L'utilisation de ce nouveau produit permet non-seulement d'éliminer la source du problème (la corrosion), mais aussi, d'apporter d'autres avantages et d'autres dimensions de service, dont l'armature conventionnelle ne possède pas de par sa nature. Le comportement des tiges en matériaux composites à base de fibres en tant qu'armature à béton est mal connu et peu documenté. La présente thèse porte sur l'analyse et le design en flexion statique de poutres en béton armé de barres PRF et comporte deux volets: un volet expérimental et un volet théorique. L'étude expérimentale réalisée dans le cadre de cette thèse a permis d'évaluer l'effet du pourcentage d'armature PRF, de la résistance à la compression du béton, de la hauteur de la poutre et du type d'armature (deux types de barres PRF ont été testés) sur le comportement en flexion des poutres armées de barres PRF. La partie théorique de cette thèse a permis d'évaluer l'applicabilité de la théorie conventionnelle d'analyse et de design en flexion des poutres en béton armé, d'en apporter les modifications essentielles, à la lumière de l'étude expérimentale, et de développer une procédure de design pour poutres en béton armées de barres PRF. La synthèse des études expérimentales et théoriques permet de tirer les principales conclusions suivantes: a) La relation de GERGELY-LUTZ, adoptée par la norme CSA/CAN3-A23.3-M84 et le Code ACI318-89, a été modifiée de façon qu'elle prédise la largeur de fissure maximale dans une poutre en béton armé de barres PRF. Aussi, l'équation du Code Européen du bâtiment pour la prédiction de la largeur de fissure, a été utilisée et les modifications qui s'imposent ont été apportées. Une nouvelle relation permettant le choix de la hauteur h֌ et de la section d'armature PRF A֌ d'un élément en béton armé a été développée. La déflexion de cet élément fléchi sera égale à celle d'un élément en béton armé de barres d'acier, de hauteur hα et de section d'armature Aα. Aussi une étude numérique et paramétrique de cette relation a permis de développer des abaques, pour une utilisation pratique, fournissant le meilleur choix de la hauteur h֌ et de la section d'armature PRF. Dans des conditions géométriques, d'essai et de chargement identiques, les barres d'armature PRF, testées dans le cadre de la présente thèse, se déforment 3,5 fois plus que les barres conventionnelles. Aussi, dans ces mêmes conditions, le béton des poutres armées de barres PRF se déforme environ deux fois plus que le béton des poutres armées de barres d'acier. Les deux théories de design, soient les états limites et les contraintes admissibles, ont été discutées et utilisées pour les poutres en béton armé de barres PRF. Enfin, une méthodologie de design pour poutres en béton armé de barres PRF a été développée. Les résultats de cette recherche ont permis à date de produire trois publications dans des revues. Ces publications sont jointes aux annexes A, B, et C

Caractérisation des vésicules intralamellaires des chloroplastes de Lemna Minor L

Ce travail consiste à caractériser les vésicules intralamellaires des chloroplastes de Lemna minor L. L'objectif principal est d'identifier les constituants biochimiques des vésicules intralamellaires (VI) afin de comparer leur composition à celle des systèmes membranaires avoisinants et à celle des plastoglobules retrouvés dans le stroma. Les classes de composés rapportés dans les VI sont les lipides, les protéines, les pigments et les prénylquinones. La méthode d'extraction et le degré de pureté des fractions de vésicules intralamellaires avaient déjà été évalués de façon qualitative en microscopie électronique. Des analyses biochimiques de la composition lipidique de la fraction de vésicules intralamellaires après une et deux purifications confirment la pureté de la fraction. Les lipides ont été analysés par chromatographie sur couche mince de silice G et par chromatographie en phase gazeuse. Des électrophorèses SDS-PAGE dénaturantes et non-dénaturantes nous ont permis de séparer les complexes photosynthétiques et les protéines. Les pigments et les prénylquinones ont été séparés et purifiés par chromatographie sur couche mince de silice et quantifiés respectivement à l'aide de leur spectre d'absorption dans la lumière visible et dans l'ultraviolet. Ces analyses étaient effectuées sur les vésicules intralamellaires et sur les membranes photosynthétiques des chloroplastes de la L. minor, à l'exception des lipides des membranes photosynthétiques. Ces dernières ont déjà été faites par Laroche (1983). Les résultats et les principales conclusions se résument comme ceci: La composition biochimique des vésicules intralamellaires des frondes de L. minor est différente de celle des plastoglobules. En plus des lipides neutres et des prénylquinones qui sont les principaux constituants des plastoglobules, les VI contiennent des lipides polaires (DGG, DDG, PL et SL), des pigments et des protéines. En général, la composition en lipides polaires des vésicules intralamellaires est semblable à celle des membranes thylacoïdiennes et de la membrane interne de l'enveloppe. Les pigments sont présents dans des proportions semblables dans les membranes photosynthétiques et les vésicules intralamellaires. La composition en prénylquinones des vésicules intralamellaires est formée d'un mélange de quinone membranaires et de leurs précurseurs. Les vésicules intralamellaires contiennent tous les complexes photosynthétiques rencontrés dans les membranes photosynthétiques. Le gel dénaturant démontre que les deux fractions ont plusieurs protéines en commun. Contrairement aux membranes photosynthétiques, la bande protéique de 32 kD est la deuxième bande la plus importante dans les VI, la première étant de 28 kD. De plus, une protéine de 47 kD est localisée uniquement dans les thylacoïdes et une protéine de 31 kD se retrouve uniquement dans les VI. Nous constatons que la vésicule intralamellaire contient tous les éléments biochimiques permettant de supposer la présence d'une membrane à sa périphérie, une membrane dont la composition serait comparable à celle des membranes photosynthétiques. D'un point de vue ontogénique, nous proposons que les vésicules intralamellaires soient formées à partir de la membrane interne de l'enveloppe et qu'elles participent à l'élaboration des membranes photosynthétiques. Certains constituants des vésicules intralamellaires se lieraient à l'extrémité des thylacoïdes et une partie de leur contenu riche en lipides neutres et en quinones serait libéré dans le stroma sous forme de plastoglobules