Identification by mutational analysis of four critical residues in the molybdenum cofactor domain of eukaryotic nitrate reductase

AbstractThe nucleotide sequence of the nitrate reductase (NR) molybdenum cofactor (MoCo) domain was determined in four Nicotiana plumbaginifolia mutants affected in the NR apoenzyme gene. In each case, missense mutations were found in the MoCo domain which affected amino acids that were conserved not only among eukaryotic NRs but also in animal sulfite oxidase sequences. Moreover an abnormal NR molecular mass was observed in three mutants, suggesting that the integrity of the MoCo domain is essential for a proper assembly of holo-NR. These data allowed to pinpoint critical residues in the NR MoCo domain necessary for the enzyme activity but also important for its quaternary structure

THESEUS1 and RALF34 monitor cell wall integrity

The cell wall is a rigid network being the first barrier between a plant cell and its environment, but at the same time has to be a dynamic network whose cell growth and shape is given by deposition and remodeling of the cell wall. Maintaining cell wall integrity (CWI) is essential for correct plant development and stress response. Members of the family of Catharanthus roseus receptor-like kinase 1-like (CrRLK1L) proteins have been shown to play a role in cell wall homeostasis, mechanoperception, CWI maintenance and growth control. One of the 17 members in Arabidopsis, THESEUS1 (THE1), was identified in a suppressor screen of a cellulose deficient mutant, revealing that the reduction in growth is part of a THE1-mediated compensatory response to cell wall perturbation (Hématy et al., 2007). Interestingly, several CrRLK1L members have been shown to be receptors for Rapid Alkalinisation Factor (RALF) peptides. RALFs are on average 50 amino acids highly basic, cysteine-rich peptides, most of which are predicted to be cleaved from a highly acidic prodomain by a subtilisin protease. Recently, THE1 has been identified as a receptor for RALF34 (Gonneau et al., 2018). However, this peptide might not be the only THE1 ligand, since ralf34 loss-of-function mutants do not phenocopy all aspects of the1 mutants. RALF24 and RALF31 clustered together with RALF34, based on expression values across different tissues. We generated CRISPR/Cas9 mutants on RALF24, RALF31 and RALF34 with the aim to study which THE1 responses depend on these peptides. Our data suggest that RALF34 could not be the ligand for CWI response of THE1. The presence of RALF34 is acting negatively through THE1, inhibiting its response to cell wall damage.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech

La machinerie de biosynthèse de la cellulose (une cible pour améliorer l'utilisation de la biomasse végétale.)

La production de biocarburants de deuxième génération basée sur la transformation de la biomasse végétale est une question d actualité. La biomasse végétale est représentée par les parois des cellules, qui consistent en un réseau de microfibrilles de cellulose et de polysaccharides enchâssés dans de la lignine. Pour exploiter pleinement le potentiel de cette biomasse, il est nécessaire d apporter des connaissances complémentaires sur les mécanismes de biosynthèse de ces polymères pariétaux. Par exemple, il est important d améliorer le rendement de saccharification des microfibrilles de cellulose afin de produire de plus grandes quantités de bioéthanol. Nous avons donc combiné des études basées sur le modèle bien connu Arabidopsis et sur Brachypodium distachyon, la nouvelle espèce modèle pour les graminées tempérées et les céréales monocotylédones dédiées à la production de biocarburants. La cellulose est synthétisée par des complexes membranaires de cellulose synthases (CSC) qui contiennent les sous-unités catalytiques de cellulose synthase (CESAs), et cela requiert d autres partenaires parmi lesquels KOR1, une endo-b-1,4-glucanase. Le trafic intracellulaire des CESAs semble jouer un rôle crucial dans la régulation du niveau de la synthèse de la cellulose. Nous avons étudié en détails le trafic intracellulaire de KOR1 dans des hypocotyles d Arabidopsis cultivés à l obscurité. En parallèle, lors d un crible visuel de la collection de mutants de Brachypodium de l INRA de Versailles, nous avons sélectionné un mutant nommé spa. Ce mutant partage des caractéristiques avec les mutants brittle culm du riz et de l orge, comme par exemple des tiges cassantes, un xylème irrégulier, et une importante déficience en cellulose, surtout au niveau des tiges, qui contiennent 50% de la quantité retrouvée dans une plante sauvage. Des dosages de lignine ont montré une augmentation significative chez spa. De façon itnéressante, ce mutant présente un défaut flagrant du port érigé, au contraire des mutants brittle culm qui sont parfaitement érigés. Les défauts mécaniques du mutant spa s illustrent par un module de Young trois fois inférieur à celui d une plante sauvage. Des approches complémentaires ont été mise en œuvre afin d identifier les défauts génétiques responsables de ce phénotype : le séquençage de gènes candidats reliés à la synthèse de la cellulose a été réalisé ainsi qu une approche de NGS. De plus, dans le cadre du projet Européen RENEWALL et du projet KBBE CellWall, et grâce à l outil BradiNet (M.Mutvil, KBBE CellWall) permettant d accéder aux réseaux de co-expression, des stratégies RNAi sont en cours afin d inactiver certains gènes seléctionnés selon des critères d expression spécifiques, et selon leur implication potentielle dans la synthèse de la cellulose, spécifiquement chez les monocotylédones. Parmi ces gènes nous nous sommes concentrés sur la famille des MAP65 (Microtubules Associated Proteins), qui pourraient, au vu de la relation étroite entre microtubules et microfibrilles, jouer un rôle dans la déposition de la cellulose.The production of second-generation biofuels based on the transformation of plant biomass is a pressing issue. Biomass is represented by cell walls of the plant cells consisting of a network of cellulose microfibrils and polysaccharides encrusted by lignin. To enhance the potential of plant biomass, we need to provide insights on the mechanisms of the biosynthesis of cell wall polymers. For example, it is important to improve the saccharification yield of cellulose microfibrils to produce the highest amount of bioethanol. We therefore combine studies on the well-known model plant Arabidopsis and Brachypodium distachyon, the new model species for temperate graminae and monocotyledonous crops dedicated to biofuel production. Cellulose is synthesized by plasma membrane-bound cellulose synthase complexes (CSC) containing cellulose synthase proteins (CESAs) and requires other partners among which the endo-beta1,4 glucanase KOR1. The intracellular trafficking of CESAs seems to be crucial to regulate the cellulose synthesis rate. We investigated in detail the intracellular trafficking of KOR1 in Arabidospis dark-grown hypocotyls.In parallel we selected by visual screening of the Versailles collection of mutagenized Brachypodium distachyon a mutant called spa. This mutant shares characteristics of the brittle culm mutants of rice and barley, such as brittleness, irregular xylem, and a cellulose content deficiency especially in stems, with 50% of the amount found in the wild type. Lignin assays indicate a higher amount of lignin in spa. Interestingly, this mutant is also "floppy" unlike others brittle culm mutants which are fully erected and the mechanical strength defects of spa is illustrated by a Young s modulus three times lower than that of WT. Complementary approaches were used to identify the SPA gene: sequencing of candidate genes related to cell wall synthesis or co-expressed with secondary cell wall cellulose synthases and a classical mapping strategy combined with NGS methods. Moreover within the framework of the European RENEWALL and KBBE CellWall projects and thanks to the co-expression network tool BradiNet (M. Mutwil, KBBE project), RNAi strategies are in progress to inactivate a few genes selected according to specific expression criteria and potentially involved in cell wall synthesis specifically in monocots. Among these genes we are focusing on the MAP65 family (Microtubules Associated Proteins), which could play a role in cellulose deposition according to the close relationship between microfibrils and microtubules.PARIS11-SCD-Bib. électronique (914719901) / SudocSudocFranceF