The role of posttranslational modifications in the endocytosis of muscle-specific kinase

Die Rezeptor-Tyrosin-Kinase MuSK (muscle-specific kinase) ist ein Muskel-spezifisches Transmembranprotein und essentiell für die Bildung der Neuromuskulären Synapse an der Kontaktstelle von Motorneuron und Muskel. MuSK wird durch das Proteoglykan Agrin aktiviert, ein Protein, das an Nervenendigungen sekretiert wird. Aktiviertes MuSK auto-phosphoryliert and stimuliert die Aggregation von Acetylcholin-Rezeptoren (AChRs) in dem der Nervenendigung gegenüberliegenden Bereich der Muskelzell-Membran. Dies führt zur Ausbildung eines postsynaptischen Apparates. Um diese Prozesse zu koordinieren sind komplexe Signalmechanismen erforderlich, welche in den vergangenen Jahrzehnten intensiv studiert wurden. Zahlreiche weitere Proteine, die an der Bildung der Neuromuskulären Synapse beteiligt sind, wie LRP4, Dok7 und Tid1, wurden mittlerweile identifiziert und ihre Interaktion mit MuSK wurde erforscht. Dennoch sind die Kenntnisse über die Agrin-MuSK-Signalkaskade unvollständig. Es wurde berichtet, das Aktivierungs-abhängige Endozytose von MuSK für die Aggregation von AChR erforderlich ist. Darauffolgende Modifikation von MuSK durch Ubiquitinylierung könnte den intrazellulären Transport der Kinase regulieren. Diese Diplomarbeit konzentrierte sich auf darauf, nicht-Muskel Zellsysteme zu etablieren, in welchen die beiden Prozesse, MuSK Endozytose und MuSK Ubiquitinylierung, untersucht werden können. Heterologe Zellsysteme sind einfacher zu handhaben als Muskelzellsysteme und erlauben es, bestimmte Komponenten der Agrin-MuSK Signalkaskade unabhängig von anderen Muskel-spezifischen Proteinen zu exprimieren und zu untersuchen. Ein Ziel dieser Arbeit war, ein Modellsystem zu erschaffen, in welchem heterolog-exprimiertes MuSK zu einem definierten Zeitpunkt aktiviert werden kann. Es wurde getestet, ob die Kinase durch Dimerisierung mittels Antikörpern zu stimulieren ist. Ebenso wurde versucht, MuSK mit dem Agrin-Rezeptor LRP4 zu ko-exprimieren und mit Agrin zu aktivieren. Leider erzielten beide beschriebenen Methoden keine detektierbare Aktivierung. Daher wurde eine konstitutiv inaktive, unphosphorylierte und eine konstitutiv aktive, phosphorylierte MuSK-Mutante entsprechend der experimentellen Anforderungen modifiziert. Internalisierungsstudien mit diesen zwei Mutanten legten nahe, dass der Phosphorylierungszustand von MuSK keine Auswirkung auf deren Endozytose und den intrazellulären Transport hat. Um den Effekt von MuSK-Ubiquitinierung auf die Internalisierung der Kinase zu untersuchen, wurden HA-markierte MuSK-Ubiquitin Chimären HA-MuSK-Ubwt und HA-MuSK-Ubmut kloniert. Es wurde gezeigt, dass HA-MuSK-Ubwt, welches die extrazelluläre und die Transmembrandomäne fusioniert an Wildtyp-Ubiquitin enthält, in COS-7 Zellen polyubiquitinyliert wird. HA-MuSK-Ubmut, welches zwei Mutationen im Ubiquitin-Teil enthält, wird großteils mittels Anhängen eines einzelnen Ubiquitin-Moleküls modifiziert oder bleibt unmodifiziert. Es wurde festgestellt, dass MuSK-Ubiquitinylierung, ähnlich wie der Phosphorylierungszustand, keinen signifikanten Einfluss auf seine Internalisierung und den Transport innerhalb der Zelle hat.The receptor tyrosine kinase MuSK (muscle-specific kinase) is a muscle-specific, transmembrane protein that is essential for the formation of the neuromuscular junction at the site of contact of motor neuron and muscle. MuSK is activated via the proteoglycan agrin, a soluble protein secreted by nerve terminals. Activated MuSK autophosphorylates and stimulates aggregation of acetylcholine receptors (AChRs) in the area of the muscle cell membrane that opposes the nerve terminal. Consequently a postsynaptic apparatus is established. To coordinate these processes complex signaling mechanisms are required, which have been studied extensively in the past decades. Numerous additional proteins involved in neuromuscular junction formation like LRP4, Dok7 and Tid1 have been identified and their interaction with MuSK has been investigated. However, the knowledge about agrin-MuSK-signaling is still incomplete. Activation-dependent endocytosis of MuSK has been reported to be required for AChR clustering. Subsequent modification of MuSK by ubiquitination might control intracellular trafficking of the kinase. This diploma thesis focused on the establishment of non-muscle cell systems for the investigation of the two processes, MuSK endocytosis and MuSK ubiquitination. Heterologous cell systems are easier to handle than muscle cell systems and allow the selective expression and characterization of distinct components of the agrin-MuSK-signaling cascade independent from other muscle-specific proteins. Initially, the goal was to create a model system, in which heterologously expressed MuSK could be activated at a defined time point. Stimulation by clustering with antibodies was tested. It was also tried to co-express MuSK with the agrin-receptor LRP4 and activate it with agrin. Unfortunately the respective methods did not result in detectable induction. Hence, constitutively inactive, unphosphorylated and active, phosphorylated MuSK mutants were modified according to the experimental requirements. Internalization studies with these two mutants suggested that the phosphorylation level of MuSK has no effect on its endocytosis and intracellular trafficking. To study the effect of ubiquitination on MuSK internalization, HA-tagged MuSK-ubiquitin chimeras HA-MuSK-Ubwt and HA-MuSK-Ubmut were created. HA-MuSK-Ubwt comprising the extracellular and transmembrane domain of MuSK fused to wild-type ubiquitin, was shown to be polyubiquitinated upon expression in COS-7 cells. HA-MuSK-Ubmut contains two mutations in the ubiquitin portion and is rather modified by addition of a single ubiquitin molecule or not modified at all. But similar to phosphorylation levels, the extent of ubiquitination was found not to significantly influence internalization and protein targeting

Immobilization Techniques and Integrated Signal Enhancement for POC Nanocolor Microfluidic Devices

Resonance enhanced absorption (REA) nanocolor microfluidic devices are new promising bioassay platforms, which employ nanoparticle- (NP-) protein conjugates for the immunodetection of medically relevant markers in biologic samples such as blood, urine, and saliva. The core component of a REA test device is a PET chip coated with aluminum and SiO2 thin layers, onto which biorecognitive molecules are immobilized. Upon addition of a sample containing the analyte of interest, a NP-protein-analyte complex is formed in the test device that is captured on the REA chip, for example, via streptavidin-biotin interaction. Thereby, a colored symbol is generated, which allows optical readout. Silver enhancement of the bound nanoparticles may be used to increase the sensitivity of the assay. Herein, we demonstrate that adsorptive immobilization via a cationic polymeric interlayer is a competitive and fast technique for the binding of the capture protein streptavidin onto planar SiO2 surfaces such as REA biochips. Moreover, we report the development of a silver enhancement technology that operates even in the presence of high chloride concentrations as may be encountered in biologic samples. The silver enhancement reagents may be integrated into the microfluidic assay platform to be released upon sample addition. Hereby, a highly sensitive one-step assay can be realized