U susret poboljšanju procene rasta ribe: multi-modelna analiza i njena primena kod slatkovodnih riba

Cilj ovog istraživanja je bio da se uporedi multi-modelna analiza (MMI) u modelovanju rasta riba sa tradicionalnom metodom odabira najbolje odgovarajućeg modela kod slatkovodne ribe Carassius gibelio (Bloch 1782). Korištena su četiri modela (Von Bertalanffy, Gompertz, Robertson i power funkcije) za modelovanje rasta jedinki vrste Carassius gibelio iz reke Stari Begej. Iako je Power funkcija bila najbolje odgovarajuća, u svim slučajevima je više od jednog modela bilo značajno podržano te je stoga primenjeno usrednjavanje modela kako bi se dobili srednji model i tempo rasta. Kada je više od jednog modela podržano, preporučeno je da se koristi MMI koja omogućuje preciznije određivanje parametara rasta

Transplantacija spermatogonija kao nova metoda u akvakulturi i konzervaciji riba

Poslednjih godina, primena primordijalnih germinativnih ćelija (primordial germ cells - PGCs) i spermatogonijalnih stem ćelija (spermatogonial stem cells - SSCs) riba je postala veoma značajna zbog razvoja metode transplantacije ovih ćelija. Od kada su Brinster i Avarbock (1994) razvili ovu metodu, ona se uspešno koristi za čuvanje genetskog materijala ugroženih vrsta i u stvaranju novih transgenih linija kod miševa i domaćih životinja. Uvođenje ove metode kod riba predstavlja značajan napredak u oblasti reproduktivne biotehnologije, akvakulture, konzervacione biologije, kao i u razvoju novih transgenih linija različitih vrsta riba. Osnovu ove metode predstavlja transplantacija germinativnih ćelija (PGC, SSC) iz donorskog organizma u organizam primaoca. Najinteresantnija u tom smislu je upotreba nediferenciranih spermatogonija A tipa (Aund) koje imaju sposobnost samoobnavljanja ali i proizvodnje ćelija kasnijih faza spermatogeneze. Postoji takođe nekoliko specifičnih osobina SSC koje ih čine pogodnim za transplantaciju: (1) sposobnost da kolonizuju testis primaoca odakle produkuju donorsku spermu, (2) mogućnost da se nakon transplantacije u primaocu muškog pola razviju u spermatogonije, a u primaocu ženskog pola u oogonije i (3) mogućnost genske manipulacije sa ciljem produkcije transgenih riba (Lacerda i sar., 2010). Prilikom transplantacije SSC, posebna pažnja mora biti usmerena ka izboru vrste donora i primaoca. Najbolje bi bilo da donor i primalac ne budu filogenetski previše udaljeni, kao i da primalac ima kratak reproduktivni ciklus i manje dimenzije tela kako bi ekonomski bio pogodniji za gajenje. Donorska vrsta je obično vrsta za koju postoji određneni interes, bilo ekonomski, naučni ili konzervacioni. Tokom transplantacije, kompatibilnost između primaoca i donora može biti ograničavajući faktor u uspehu samog procesa. U najgorem slučaju, primalac, usled imune reakcije, može u potpunosti odbaciti transplantirano tkivo ili ćelije. To je najčešće slučaj ukoliko se vrši transplantacija SSC iz odraslog donora u odraslog primaoca. Kako bi se izbegao problem izazvan transplantacijom između dve odrasle jedinke, koristi se prednost ontogenije primaoca, posebno ontogenije njegovog imunog sistema, tako što se za primaoca koriste embrioni ili larve. Ovi stadijumi kod riba nemaju razvijen imuni sistem niti diferencirane T-ćelije (Takeuchi et al., 2003; Yoshizaki et al., 2011) te s toga nemaju mehanizam pomoću kojeg bi odbacili donorsko tkivo. Takođe, lakše je blokirati razvoj endogenih primordijalnih germinativnih ćelija kod larvi, nego ukloniti SSC iz već razvijenih gonada kod odraslog donora. Pored odabira odgovarajuće vrste donora i primaoca, neophodno je na pravi način izolovati specifične ćelije koje treba da budu transplantirane. Ovaj proces je donekle jednostavniji kada je u pitanju tansplantacija PGC s obzirom na njihov daleko manji broj u odnosu na spermatogonije i na to da one još uvek nisu potpuno razvijene u gonadama. S druge strane, SSC su dobro razvijene u gonadama i najčešće zauzimaju karakteristično mesto unutar pojedinačnih niša u testisu specifičnih za tu vrstu ćelija. Prilikom izolacije nediferenciranih spermatogonija A tipa iz testisa odrasle jedinke, veome je bitno voditi računa od morfologiji tih ćelija kao i specifičnim markerima pomoću kojih ih je moguće razlikovati od ostalih tipova spermatogonija (Adiff, B), spermatocita i spermatida. Osnovne histološke metode u kombinaciji sa imunohistohemijom, in situ hibridizacijom ili in situ PCR metodom se mogu koristiti za identifikaciju spefifičnih molekularnih markera (proteina ili RNK) u ćelijama unutar ćelijskih niša i koji se u daljem toku rada mogu koristiti za izolaciju određenih ćelija. Pre transplantacije PGC ili SSC, neophodno je izolovati željene ćelije iz donorskog tkiva. Nakon multienzimske razgradnje tkiva testisa, ćelije se izoluju na osnovu njihove morfologije i veličine i/ili specifičnih molekularnih markera zbog kojih čitav proces može biti species-specifičan. Kombinacija transplantacije PGS i SSC sa krioprezervacijom daje dodatni značaj ovoj metodi s obzirom da još uvek ne postoji optimizovan protokol za uspešnu krioprezervaciju jaja i embriona riba, pre svega zbog prisustva velike količine žumanceta i masti. Krioprezervacija ćelija kao što su PGS i SSC, koje imaju mogućnost da produkuju spermatozoide ili oocite u zavisnosti od pola jedinke primaoca, ima izuzetno veliku perspektivu primene u konzervacionoj biologiji i akvakulturi. Istraživanja su pokazala da krioprezervirane SSC nakon odmrzavanja i transplantacije u telo primaoca mogu proizvesti spermatozoide i oocite donorske vrste (Kobayashi et al., 2007). Na taj način, čuvanje gameta nije neophodno jer krioprezervacijom germinativnih ćelija i njihovom transplantacijom, moguće je dobiti gamete oba pola.In recent years, the importance of manipulations of primordial germ cells (PGCs) and spermatogonial stem cells (SSCs) in fish has drastically increased due to development of transplantation method of these cells. Since its development by Brinster and Avarbock (1994), this method has been successfully used in the preservation of genetic material of endangered species and in the creation of new transgenic lines of mice and farm animals. Introduction of this method in fish leads to advances in reproductive biotechnology, aquaculture, development of new transgenic lines and conservation biology of fish. The base of this method lies in the transplantation of the germinative cells (PGCs, SSCs) from donor organism into recipient organism. Undifferentiated spermatogonia type A (Aund) which have the ability of self-renewal are the most interesting for transplantation since they have the ability of self-renewal, but can also produce later stage cells. There are several advantages of using SSCs in transplantation process: (1) the capability of SSCs to colonize the testis of the recipients where they are able to produce donor-derived sperm, (2) plasticity in development since SSCs can develop into spermatogonia in male recipients and oogonia in female recipients and (3) the possibility of genetic manipulation in SSCs in order to produce transgenic fish (Lacerda et al., 2010). When transplanting SSCs, special attention must be given to the choice of donors and recipients species. It is best that donor and recipient organisms are phylogenetically not too distant, that recipient organisms have a short reproductive cycle and that they are small for a more economic rearing. Donor species are usually species which attract certain interest, whether its an economic, scientific or conservation interest. During transplantation, compatibility between recipient and donor may be a very limiting factor in transplantation success. In the worst-case scenario, recipients may completely reject the transplanted tissue or cells due to immunological reaction. This is especially the case when transplanting SSCs isolated from adult donors into adult recipients. In order to evade the problems caused by adult-adult transplantations, scientists have taken advantage of the ontogeny of recipients, mainly the ontogeny of their immune system, and used embryos and larvae as recipients. Embryos and larvae do not have a developed immune system nor differentiated T-cells (Takeuchi et al., 2003; Yoshizaki et al., 2011), therefore they do not have mechanisms to reject the donor tissue. Furthermore, it is easier to knock-out larval endogenous PGCs than to deplete SSCs from already developed gonad. Apart from choosing the right donor and recipient organisms, it is necessary to isolate specific cells that need to be transplanted. This is to some extent easier when transplanting PGCs, since there are fewer of them than SSCs, and they have not yet fully developed inside the gonads. On the other hand, SSCs are well developed inside the gonads and usually take their specific place within the spermatogonial stem niche. When isolating undifferentiated spermatogonia type A from adult testis, special attention must be given to their morphology and specific markers that distinguish them from other types of spermatogonia (Adiff, B), spermatocytes and spermatids. Basic histology may be coupled with immunohistochemistry, in situ hybridization or in situ PCR which would enable the identification of specific molecular markers within the cells of the niche (proteins or RNA). All this data can be further used in isolation of particular cells. Prior to transplantation, PGCs and spermatogonia need to be isolated from the donor tissue. After multi-enzymatic digestion it is possible to isolate cells based on their morphology and size, and/or specific molecular markers and the whole process can be species-specific. A great advantage of transplantation of PGCs and SSCs is that this method can be very well combined with cryopreservation. There are still no optimized protocols for cryopreservation of fish eggs and embryos, mostly due to presence of large amount of yolk and fat. Since PGCs and SSCs can develop into both sperm and eggs, cryopreservation of these cells could have a great perspective in conservation biology but also in aquaculture. Studies have shown that frozen/thawed SSCs transplanted into recipients give rise to potent donor sperm and eggs in the recipients (Kobayashi et al., 2007). In this way, there is no need to conserve both sperm and eggs since successful cryopreservation of germ cells can give rise to both sperm and eggs after transplantation

Vitrifikacija mleča grgeča (perca fluviatilis)

Vitrifikacija je proces dovođenja vode ili rastvora u čvrsto stanje, odnosno u amorfno ili staklasto stanje koje može da se dostigne veoma brzom hlađenjem (106-1010 °C/s). Nedavno je objavljeno nekoliko istraživanja o vitrifikaciji mleča različitih vrsta riba, međutim nema dostupnih informacija o vitrifikaciji mleča grgeča (Perca fluviatilis). Mužjaci grgeča su uzorkovani 6 dana posle hormonske injekcije (250 IU kg-1 hCG). Evaluirana je pokretljivost spermatozoida pomoću sistema kompjuterske analize sperme CASA. Za process vitrifikacije mleč je razblažen modifikovanim Tanaka ekstenderom na finalni odnos 1:5 (sa krioprotektantima). Posle preliminarnih testova sa kombinacijom metanola i propilen glikola (PG) u različitim koncentracijama, odlučeno je da se koristi 15% metanola i 15 % PG (ukupno 30% krioprotektanata). Suspenzija mleča je ubačena direktno u tečni azot bez prethodnog hlađenja u njegovoj pari. Za sve eksperimente vitrifikacije za hlađenje su korišćene cevčice Cryotop (Kitazato-Dibimed, za 2 µl rastvora). Za fertilizacioni test su prikupljena jaja ženki grgeča. Vitrifikovane Cryotop cevčice otopljene su direktno u 10 µl rastvora za aktivaciju (50 mm NaCl) u petri šoljama koje su sadržale jaja. Svež mleč služio je za kontrolu. Oplođena jaja su inkubirana u plivajućem sistemu. Izvedena su 3 ogleda da bi se utvrdio odgovarajući broj cevčica Cryotop za svaku seriju jaja: 1, 6 i 18 cevčica Cryotop je isprobano za svaku seriju jajnih ćelija. U 2 µl rastvora mleča jedne Cryotop cevčice bilo je oko 0,33 µl mleča. Na osnovu stepena oplođenja u tri ogleda može se zaključiti da povećanje broja Cryotop cevčica pojačava stepen oplođenja. Dalja sitraživanja su neophodna da bi se razvio metod vitrifikacije sa većim preživljavanjem larvi posle oplođenja vitrifikovanim mlečom. Takođe je potrebno ispitati stepen izvaljenih embriona iz ogleda sa vitrifikovanim mlečom, kao i potencijalni uticaj vitrifikacije na larve, pre svega na deformitete i morfološke promene

Histološka procena zrelosti gonada ženki linjaka (Tinca Tinca L.) iz ribnjaka Žabeni (Republika Makedonija)

The aim of this study was to assess the status of the female tench gonads and presence and morphological characteristics of oocytes during the spawning period. Sampling was conducted on the Žabeni fish ponds during April and July 2013. Different types of follicles with varying dimensions were observed. During April, all types of follicles except the E type were observed. This meant that the individuals were ready for the spawning period. During July, the individuals have already released one batch of eggs, and were ready for the release of another. Results of this research implicate the significance of histological analysis of gonads considering it enables a detailed obserevation of the gonadal sructure and characteristics of oocytes.Cilj rada je bio da se na osnovu histološke analize gonada ženki linjaka utvrdi njihovo stanje i zastupljenost različitih tipova i morfoloških osobina oocita u toku perioda mresta. Uzorkovanje je vršeno na ribnjaku Žabeni (Republika Makedonija) tokom aprila i jula meseca 2013. godine. Pregledom histoloških preparata utvrđeno je postojanje različitih tipova folikula koji su varirali u veličini i površini. U toku aprila nisu uočeni folikuli E tipa, ali je na osnovu zastupljenosti ostalih tipova, bilo jasno da su jedinke spremne za sezonu mresta. Pregledom uzoraka iz jula utvrđeno da su jedinke prethodno oslobodile najmanje jednu porciju jaja (ikre), kao i da sledi bar još jedna porcija. Dobijeni rezultati ukazuju na značaj histološkog pregleda gonada s obzirom da pruža mogućnost detaljnijeg uvida u strukturu gonada kao i osobine pojedinačnih oocita

Osobine sperme u toku skladištenja nakon krioprezervacije kod linjaka (Tinca Tinca l.): Značaj za akvakulturu

The aim of this study was to test the effects of various cryoprotectants on the motility of tench sperm, and also on the sperm features one hour after thawing. Two experimental groups were formed, each for different cryprotectants. Methanol was used in the first group, and DMSO in the second. Results displayed statisticaly significant differences in sperm motility between groups right after thawing. The test was continued only for the methanol group which showed satisfying progressive motility right after thawing. During the one hour post-thawing storage test, there were no significant differences in the progressive motility which indicated that the combination of methanol (10%) and Grayling extender presnt a favorable combination for cryopreservation and storage of tench sperm.Cilj rada je bio da se ispita uticaj različitih krioprotektanta na pokretljivost spermatozoida linjaka nakon krioprezervacije, kao i na njihove osobine u toku jednog časa nakon odmrzavanja. Formirane su dve eksperimentalne grupe u zavisnosti od krioprotektanta. U prvoj grupi uzorak je pripreman sa metanolom, a u drugoj sa DMSO. Rezultati su pokazali da odmah nakon odmrzavanja postoji statistički značajna razlika u progrisvnom motilitetu testiranih grupa te je test skladištenja mogao biti nastavljen jedino sa uzorkom sa metanolom za koje su dobijene zadovoljavajuće vrednosti. U toku jednog časa skladištenja nije došlo do statistički značajne promene u pokretljivosti. Može se zaključiti da je kombinacija metanola (10%) i Grayling ekstendera veoma zadovoljavajuća za krioprezervaciju i skladištenje sperme linjaka

Uspešnost sperme linjaka (Tinca Tinca L., 1758) nakon krioprezervacije u oplodnji i izleganju

Tench Tinca tinca (L., 1758) is a fish species with big potential in aquaculture and for which there is a great interest for improving rearing and reproduction techniques. The aim of this study was to test the efficiency of different cryoprotectants (methanol and DMSO) and extenders (Kurokura 180 and Grayling) during sperm cryopreservation on fertilization and hatching rates. Cryopreserved sperm had significantly lower fertilization and hatching success than control group. Samples cryopreserved with Grayling extender had higher fertilization and hatching success, independently of the cryoprotectant used, therefore pointing out the significance of use of sugar-based extenders in the cryopreservation of tench sperm.Linjak Tinca tinca (L., 1758) je vrsta ribe sa velikim potencijalom u akvakulturi i interes za unapređenjem tehnika za njeno gajenje rastu tokom proteklih decenija. Cilj ovog rada bio je testiranje uticaja različitih krioprotektanata (metanol i DMSO) i ekstendera (Kurokura 180 i Grayling) tokom krioprezervacije sperme na uspešnost oplodnje i izleganja kod linjaka. Sve eksperimentalne grupe su imale značajno niže vrednosti stepena oplodnje i izleganja od kontrole. Uzorci krioprezervirani sa Grayling ekstenderom su pokazali veću uspešnost oplodnje i izleganja bez obzira na korišćeni krioprotektant što ukazuje na značaj upotrebe ekstendera na šećernoj bazi u krioprezervaciji sperme ove vrste

The influence of shaped TiO2 nanofillers on thermal properties of polyvinyl alcohol

Poly(vinyl alcohol)-based nanocomposites consisting of shaped TiO2 nanocrystals (nanoparticles, nanotubes or nanorods) were synthesized by direct blending of the polymer and a solution of titania nanocrystals or powder. In order to elucidate the influence of the shape of the titania nanocrystals on thermal stability of the polymer matrix and particles interaction with poly(vinyl alcohol) (PVA) chains, structural and thermal characterizations of PVA/TiO2 nanocomposites were performed. Faceted nanoparticles increased the thermal stability of the PVA matrix. Titania nanotubes and nanorods did not show any stabilizing effect on the polymer matrix under an argon atmosphere. The thermo-oxidative degradation temperature of PVA increased with addition of faceted TiO2 nanoparticles. The thermo-oxidative stability of the PVA matrix was affected more by the presence of titania nanotubes and nanorods in comparison with its thermal stability under an inert atmosphere. The degree crystallinity (X-c=32 %) of the PVA matrix slightly decreased in the presence of the faceted TiO2 nanoparticles in nanocomposite samples

Cryopreservation of Danube barbel Barbus balcanicus sperm and its effects on sperm subpopulation structure

© 2020. by the Serbian Biological Society. The objective of this study was to develop a successful freezing protocol for cryopreservation of Danube barbel sperm, and to identify the presence of different spermatozoa subpopulations. By testing different concentrations of different cryoprotectants, we determined that the use of 5% dimethyl sulfoxide (DMSO) yielded the highest total motility of ∼25%. Cooling rates influenced by frame height and cooling time in liquid nitrogen vapor showed that a frame height of 3 cm and cooling time of 2 min yielded the highest post-thaw motility. Supplementation of cryomedia with 0.1 M of sugars led to an increase in the total post-thaw motility by ∼50%, while protein supplementation lowered post-thaw motility. Motile spermatozoa hierarchically clustered according to their motility parameters, displaying a four-subpopulation (SP1-SP4) structure. SP1 was defined by low values of velocity but high overall linearity; SP2 was comprised of fast non-linear spermatozoa, that had high velocity values but low linearity; SP3 was characterized by fast linear spermatozoa, and SP4 by slow non-linear spermatozoa. Protocols developed in this study will lead to the creation of new and enhanced conservation strategies for this species