Identificação e diferenciação de espécies de Candida de pacientes pediátricos por amplificação aleatória de DNA polimórfico

Thirty-four Candida isolates were analyzed by random amplified polymorphic DNA using the primer OPG-10:24 Candida albicans; 4 Candida tropicalis; 2 Candida parapsilosis; 2 Candida dubliniensis; 1 Candida glabrata and 1 Candida krusei. The UPGMA-Pearson correlation coefficient was used to calculate the genetic distance between the different Candida groupings. Samples were classified as identical (correlation of 100%); highly related samples (90%); moderately related samples (80%) and unrelated samples (< 70%). The results showed that the RAPD proposed was capable of classifying the isolates coherently (such that same species were in the same dendrogram), except for two isolates of Candida parapsilosis and the positive control (Netherlands, 1973), probably because they are now recognized as three different species. Concerning the only fluconazole-resistant Candida tropicalis isolate with a genotype that was different to the others, the data were insufficient to affirm that the only difference was the sensitivity to fluconazole. We concluded that the Random Amplified Polymorphic DNA proposed might be used to confirm Candida species identified by microbiological methods.Trinta e quatro isolados de Candida foram analisados por amplificação aleatória de DNA polimórfico (primer OPG-10): 24 Candida albicans, 4 Candida tropicalis, 2 Candida parapsilosis, 2 Candida dubliniensis, 1 Candida glabrata e 1 Candida krusei. O coeficiente de correlação de Pearson-UPGMA calculou a distância genética entre os diferentes agrupamentos de Candida: amostras idênticas (100% de correlação), amostras muito relacionadas (90%), moderadamente relacionadas (80%), e não relacionadas (< 70%). Os resultados demonstram que a amplificação aleatória de DNA polimórfico proposta é capaz de classificar os isolados de forma coerente, ficando os de mesma espécie em um mesmo dendograma, com exceção dos dois isolados de Candida parapsilosis e o controle positivo (Holanda, 1973), provavelmente por serem atualmente classificadas em três espécies diferentes. Quanto ao único isolado de Candida tropicalis resistente ao fluconazol com genótipo diferente dos outros, os dados não são suficientes para afirmar que a única característica distinta fosse a sensibilidade ao fluconazol. Concluímos que a amplificação aleatória de DNA polimórfico proposta poderia ser usada para a confirmação das espécies de Candida identificadas nos testes microbiológicos

Molecular typing of Toxoplasma gondii. Analysis of amniotic fluid samples from pregnancies with diagnosis of congenital toxoplasmosis

Toxoplasma gondii é o agente etiológico da toxoplasmose, podendo causar diferentes formas da doença, entre elas, a toxoplasmose congênita cuja frequência varia significativamente de acordo com o país estudado. Na França, foi estimada em 1-3 casos/1.000 nativivos, enquanto nos EUA cerca de 1/10.000, porém não existem estimativas da prevalência de infecção congênita no Brasil. Toxoplasma gondii possui três linhagens clonais conhecidas como genótipos I, II e III que se relacionam aos três tipos descritos de acordo com a classificação da patogenicidade do parasita em camundongos, estando os três tipos associados a infecções humanas de maior patogenicidade, menor patogenicidade e patogenicidade intermediária, respectivamente. Os três genótipos já foram identificados na América do Norte e Europa, sendo o genótipo II predominante em infecções congênitas. O presente estudo teve como objetivo determinar a freqüência dos genótipos I, II e III de T. gondii em 85 amostras de líquido amniótico de gestantes brasileiras com toxoplasmose confirmada e adquirida durante a gestação, todas oriundas de São Paulo. Para tal, foi utilizada a técnica de multiplexnested- PCR-RFLP com amplificação simultânea de quatro fragmentos pertencentes a três genes do parasita: 3-SAG2, 5-SAG2, SAG3 e GRA6 Das 85 amostras iniciais, 76 foram positivas pelo sistema de multiplexnested- PCR (92,7%), tendo sido possível analisar o maior número de amostras no sistema que amplifica a região do gene SAG3 (69,7%), seguido do sistema 3-SAG2 (44,7%), do sistema 5-SAG2 (40,8%), e finalmente do sistema GRA6 (25%). Nas 76 amostras submetidas à genotipagem foram encontrados: 1,3% (1 amostra) do genótipo I; 71,1% (54 amostras) do genótipo II; 6,6% (5 amostras) do genótipo III; e 21% (16 amostras) para as quais não foi possível definir o genótipo parasitário após clivagem enzimática, tendo sido as mesmas submetidas ao sequenciamento. Das 16 amostras, duas não puderam seqüenciadas por falta de DNA remanescente e das 14 analisadas: duas foram definidas como tipo III, apresentando 100% de homologia com o protótipo VEG, e duas foram definidas como tipo II apresentando 100% de homologia com o protótipo ME49. Em 10 amostras foram observadas misturas de duas ou mais bases, em uma ou mais posições nucleotídicas da sequência de DNA do fragmento amplificado, sendo identificadas como recombinantes. Além disso, seis amostras identificadas pela técnica de multiplex-nested-PCR-RFLP como tipo II foram selecionadas aleatoriamente para a confirmação dos resultados e, em quatro das seis amostras, foi observada mistura de bases em outras posições nucleotídicas do fragmento amplificado, regiões estas não analisadas pela RFLP. A técnica de multiplex-nested-PCR seguida de RFLP mostrou-se útil, porém apresenta limitações no que se refere à genotipagem de amostras de líquido amniótico, uma vez que, após sequenciamento, foram reveladas várias recombinações genéticas nos fragmentos amplificados que haviam sido previamente identificados como tipo II. Sendo assim, sugerimos que, a genotipagem de T. gondii, diretamente de amostras biológicas ou após isolamento do parasita deva ser realizada pela amplificação de múltiplos genes de T. gondii e sequenciamento de todos os fragmentos amplificadosToxoplasma gondii is the etiologic agent of toxoplasmosis and may cause different forms of the disease, including congenital toxoplasmosis whose frequency varies significantly according to the country. In France, it was estimated in 1-3 cases/1,000 live births, while in the U.S. it is 1/10.000. The prevalence of congenital infection in Brazil is unknown. Toxoplasma gondii has three clonal lineages known as genotypes I, II and III which are related to the three types described according to the pathogenicity in mice, associated with human infections of high pathogenicity, low pathogenicity and intermediate pathogenicity, respectively. The three genotypes have been identified in North America and Europe, and the genotype II is the predominant one in congenital infections. This study aimed at determining the frequency of genotypes I, II and III of T. gondii in 85 amniotic fluid samples from pregnant women living in Sao Paulo, Brazil who presented with seroconversion to Toxoplasma gondii during gestation. The multiplex-nested- PCR-RFLP was performed using four different markers: 3\'-SAG2, 5\'-SAG2, SAG3 and GRA6. Eighty-five samples were initially included, but only 76 were positive in the multiplex-nested-PCR (92.7%). It was possible to examine the larger number of samples by the SAG3 gene system (69.7%), followed by 3\'-SAG2 gene (44.7%), 5\'-SAG2 gene (40.8%), and finally GRA6 gene (25%). From the 76 samples that were genotyped by the multiplexnested- PCR-RFLP, 1.3% (1 sample) was genotype I; 71.1% (54 samples) were genotype II; 6,6% (5 samples) were genotype III, and 21% (16 samples) could not be identified by RFLP and were therefore sequenced. Sequencing analysis revealed: two genotype II samples, presenting with 100% of homology with the ME49 prototype, and two were genotype III showing 100% of homology with the VEG prototype. Ten samples presented with mixture of two or more nucleotide bases in one or more nucleotide positions of the total amplified DNA sequence, so they were classified as recombinant. In addition, six samples identified by the multiplex-nested-PCR-RFLP as type II were randomly selected to confirm the results, and in four of the six samples, we observed a mixture of nucleotide bases in positions that were not analyzed by the RFLP. The technique of multiplex-nested-PCR-RFLP has proved to be useful, however, it is limited when amniotic fluid samples genotyping is concerned because after sequencing, several genetic recombinations were evidenced in samples that had been previously identified as genotype II. Therefore, we suggest that the genotyping of T. gondii, directly from biological samples or after isolation of the parasite should be performed using different targets to amplify multiple T. gondii genes followed by sequencing of all amplified fragment