Genomic convergence for identification of susceptibility genes of complex diseases

Diabetic nephropathy, a major microvascular complication of both type 1 diabetes mellitus (T1DM) and type 2 diabetes mellitus (T2DM), is an important cause of end-stage renal disease in Western nations. Despite the undoubted contribution of metabolic and hemodynamic factors in development and progression of the disease, growing evidence suggest the crucial role of genetic factors. Therefore, diabetic nephropathy is a multifactorial disease, the exact mechanisms of which remain unknown.The progress regarding the identification of the genetic architecture of the disease, including all the predisposing alleles, their frequency, the magnitude of their effect and their mode of inheritance, has proven very difficult. The reason is the identification of many predisposing alleles with small effect.Given the limited understanding of the genetic etiology of diabetic nephropathy, the current PhD dissertation aimed to identify the genetic variants that predispose to the disease. According to the methodological approach, molecular evidence-based medicine techniques were applied in available data from genetic linkage and genetic association studies.The multifactorial etiology of common disorders involving complex epistatic and gene-environment interactions reduces the likelihood that a single method could provide definitive answers. Alternatively, an integration approach combining different kinds of genetic data analysis (“genomic convergence”) has been proposed for the prioritization of promising results from the bulk of exponentially accumulating data. Evidence for the implication of a genetic locus can be considered as more valid when supported by independent research methodologies, such as linkage and association.In order to identify genetic loci linked to diabetic nephropathy, a meta-analysis of genome-wide linkage studies was performed. Methodologies developed in the Department of Biomathematics were applied for the performance of the meta-analysis. Meta-analysis has identified two novel cytogenetic locations not detected in individual scans (13q33.1-13q34, 17q24.3-17q25.3) and replicate the significance of four regions (7p22.3-7p15.3, 16p12.3-16q12.2, 21q22.11-21q22.3, 22q11.1-22q12.3) statistical significant in both weighted and unweighted analyses; however, only 22q11.1-22q12.3 reached genome-wide statistical significance.These genetic loci could merit prioritization in future studies, since further genotyping of these regions with additional markers and in extended pedigrees could contribute in the positional cloning of the responsible genes.In the field of the genetic association studies, a meta-analysis of all studies regarding genes that contribute in mechanisms of immune system was performed in order to investigate the contribution of immune system and inflammation in the pathogenesis of diabetic nephropathy. In all, 75 candidate genes of 6 KEGG pathways including 443 polymorphisms belonging to 103 studies were investigated, whereas 138 polymorphisms involved in qualitative synthesis of results. The main results of the meta-analysis is the predisposing role of polymorphisms of the CCL2, CCR5, IL6, IL8, EPO, IL1B, IL1O, IL1RN, GHRL, MMP9, TGFB1, VEGFA, MMP3, MMP12, IL12RB1, PRKCE, TNF, TNFRSF19 and IL1A in the development of diabetic nephropathy.Additionally, a field synopsis of the genetic association studies, both of candidate genes and GWAS, was performed regarding diabetic nephropathy. The main meta-analyses revealed a statistically significant predisposing role of 57 polymorphisms, of which 29 from analysis of genotypes and 28 of the analysis of alleles. These polymorphisms belong to 39 genes: , ACE, ADIPOQ, AGT, AKR1B1, APOC1, APOE, ATP1B2, ATP2A3, CARS, CCR5, CNDP1, EDN1, ENPP1, EPO, FLT4, GLO1, HMGA2, IGF2/INS/TH cluster, KCNQ1, KNG, LOC101927627, LOC105370358, MMP3, MMP12, MTHFR, NOS3, SDC2, SETD7, SIRT1, SLC12A3, SLC2A1, SLC2A2, TCF7L2, TGFB1, TIMP1, UNC13B, VEGFA and XYLT1, whereas last but not least 2 intergenic polymorphisms (rs1866813, rs4972593) should be taken into consideration in future studies.Additionally, the genomic convergence approach was applied in diabetic nephropathy studies with a genome-wide setting in order to identify genetic loci with concomitant and independent evidence of implication.Η διαβητική νεφροπάθεια αποτελεί μια μικροαγγειακή επιπλοκή του σακχαρώδους διαβήτη, τόσο του τύπου Ι, όσο και του τύπου ΙΙ, συνιστώντας τη συχνότερη αιτία νεφρικής νόσου τελικού σταδίου στον Δυτικό κόσμο. Παρά την αδιαμφισβήτητη συμβολή μεταβολικών και αιμοδυναμικών παραγόντων που μέχρι πρότινος θεωρούνται οι κατεξοχήν υπεύθυνοι παράγοντες ανάπτυξης ΔΝ, σαφείς ενδείξεις υποδεικνύουν ότι κύριο ρόλο διαδραματίζει το γενετικό προφίλ των ατόμων. Συνεπώς, πρόκειται για νόσο με πολυπαραγοντική αιτιολογία, ως αποτέλεσμα της συνεργιστικής επίδρασης γενετικών και περιβαλλοντικών παραγόντων, ο ακριβής μηχανισμός της οποίας παραμένει δυστυχώς άγνωστος μέχρι και σήμερα.Η πρόοδος όσον αφορά τον προσδιορισμό της υποκείμενης γενετικής αρχιτεκτονικής, δηλαδή του συνόλου των προδιαθεσικών αλληλόμορφων που υποκρύπτουν τη νόσο, το φάσμα της συχνότητας των αλληλόμορφων, το μέγεθος της επίδρασής τους και τον τρόπο κληρονόμησής τους, δεν αποδείχτηκε καθόλου εύκολη με την αντίληψη ότι ένα μόνο γονίδιο με μεγάλη επίδραση δεν υπάρχει. Έχουν προσδιοριστεί πολυάριθμα προδιαθεσικά αλληλόμορφα, το καθένα με μικρή επίδραση και τα οποία συνολικά συνεισφέρουν στην εκδήλωση της νόσου. Αποτέλεσμα όλης την προσπάθειας ήταν η ανίχνευση γενετικών τόπων οι οποίοι στοχεύουν σε καινούρια μονοπάτια όσον αφορά την ευπάθεια στη νόσο. Δεδομένης της ατελούς κατανόησης της γενετικής αιτιολογίας της διαβητικής νεφροπάθειας, στην παρούσα διδακτορική διατριβή τέθηκε ως στόχος η ταυτοποίηση των γενετικών παραλλαγών (πολυμορφισμών) γονιδίων που σχετίζονται με το νόσημα. Κατά τη μεθοδολογική προσέγγιση, εφαρμόστηκαν τεχνικές μοριακής ιατρικής βασισμένης σε ενδείξεις σε διαθέσιμα δεδομένα μελετών γενετικής σύνδεσης και μελέτων γενετικής συσχέτισης. Η πολυπαραγοντική αιτιολογία της διαβητικής νεφροπάθειας, όπως και των άλλων σύνθετων νοσημάτων εμπεριέχει πολύπλοκες επιστατικές αλληλεπιδράσεις, καθώς και αλληλεπιδράσεις μεταξύ γονιδίων και περιβάλλοντος, μειώνοντας την πιθανότητα ένας μοναδικός τύπος έρευνας να παρέχει οριστικές απαντήσεις. Εναλλακτικά, μια προσέγγιση ενοποίησης και συνδυασμού διαφορετικών ειδών πληροφοριών γενετικών αναλύσεων (γενετική σύγκλιση) έχει προταθεί για την απόδοση πολλά υποσχόμενων αποτελεσμάτων από τον όγκο των πληροφοριών που συσσωρεύονται εκθετικά. Απόδειξη για την εμπλοκή ενός γενετικού τόπου μπορεί να θεωρηθεί ως πιο έγκυρη όταν υποστηρίζεται από ανεξάρτητες ερευνητικές μεθοδολογίες, όπως μελέτες γενετικής σύνδεσης και μελετών γενετικής συσχέτισης. Για τον προσδιορισμό των σημαντικών γενετικών τόπων σχετιζόμενων με τη διαβητική νεφροπάθεια πραγματοποιήθηκε μια μετα-ανάλυση σαρώσεων ευρείας γονιδιωματικής σύνδεσης για τη διαβητική νεφροπάθεια. Η μετα-ανάλυση πραγματοποιήθηκε με μεθοδολογία που αναπτύχθηκε στο Εργαστήριο Βιομαθηματικών. Προσδιορίστηκαν έξι χρωμοσωμικά τμήματα με στατιστική υποστήριξη σύνδεσης (7p22.3-7p15.3, 13q33.1-13q34, 16p12.3-16q12.2, 17q24.3-17q25.3, 21q22.11-21q22.3, 22q11.1-22q12.3) αναδείχτηκαν στατιστικά σημαντικά τόσο στην κύρια ανάλυση όσο και στις υπο-αναλύσεις αναλόγως του υποκείμενου διαβήτη ταυτόχρονα στις σταθμισμένες και μη αναλύσεις, εκ των οποίων μόνο το τμήμα 22q11.1-22q12.3 παρέμεινε στατιστικά σημαντικό και σε ευρυ-γονιδιωματικό επίπεδο σημαντικότητας. Δύο από τα προαναφερθέντα τμήματα (13q33.1-13q34, 17q24.3-17q25.3) περιγράφηκαν για πρώτη φορά. Οι τόποι αυτοί συνιστούν περιοχές προτεραιότητας σε μελλοντικές έρευνες, καθώς η γονοτύπωση των συγκεκριμένων περιοχών με επιπλέον γενετικούς δείκτες θα μπορούσε να συνδράμει στον προσδιορισμό των υπεύθυνων γονιδίων για τη γενετική προδιάθεση ανάπτυξης διαβητικής νεφροπάθειας.Στον τομέα των μελετών γενετικής συσχέτισης, πραγματοποιήθηκε μετα-ανάλυση των μελετών που αφορούν γονίδια που εμπλέκονται στους μηχανισμούς του ανοσοποιητικού συστήματος ώστε να διερευνηθεί η συμβολή του ανοσοποιητικού συστήματος και της φλεγμονής στην παθογένεση της νόσου. Συνολικά, μελετήθηκαν 75 υποψήφια γονίδια που ανήκουν σε 6 μονοπάτια σύμφωνα με την ταξινόμηση της Εγκυκλοπαίδειας του Κιότο των Γονιδίων και των Γονιδιωμάτων (KEGG) και 443 πολυμορφισμοί που μελετήθηκαν σε 103 μελέτες, ενώ 138 πολυμορφισμοί συμμετείχαν στην ποσοτική σύνθεση των αποτελεσμάτων. Το κύριο εύρημα της μετα-ανάλυσης συνίσταται στο ό,τι πολυμορφισμοί στα γονίδια CCL2, CCR5, IL6, IL8, EPO, IL1B, IL1O, IL1RN, GHRL, MMP9, TGFB1, VEGFA, MMP3, MMP12, IL12RB1, PRKCE, TNF, TNFRSF19 και IL1A σχετίζονται με αυξημένο κίνδυνο εμφάνισης διαβητικής νεφροπάθειας.Παράλληλα, εκτός των προαναφερθέντων γονιδίων, πραγματοποιήθηκε μια σύνοψη πεδίου όλων των μελετών γενετικής συσχέτισης, τόσο υποψήφιων γονιδίων όσο και μελετών ευρείας γονιδιωματικής συσχέτισης, όσον αφορά τη διαβητική νεφροπάθεια. Οι κύριες μετα-αναλύσεις ανέδειξαν στατιστικά σημαντικό ρόλο για 57 πολυμορφισμούς, εκ των οποίων 29 από την ανάλυση γενοτύπων και 28 από την ανάλυση αλληλίων. Οι συγκεκριμένοι πολυμορφισμοί ανήκουν στα εξής 39 γονίδια: ACACB, ACE, ADIPOQ, AGT, AKR1B1, APOC1, APOE, ATP1B2, ATP2A3, CARS, CCR5, CNDP1, EDN1, ENPP1, EPO, FLT4, GLO1, HMGA2, IGF2/INS/TH cluster, KCNQ1, KNG, LOC101927627, LOC105370358, MMP3, MMP12, MTHFR, NOS3, SDC2, SETD7, SIRT1, SLC12A3, SLC2A1, SLC2A2, TCF7L2, TGFB1, TIMP1, UNC13B, VEGFA και XYLT1, ενώ δε θα πρέπει να θεωρηθούν ελάσσονος σημασίας 2 πολυμορφισμοί που δεν ανήκουν σε γονίδιο (rs1866813, rs4972593).Επιπρόσθετα, εφαρμόστηκε η μεθοδολογία της γονιδιωματικής σύγκλισης προς προσδιορισμό γενετικών τόπων με ταυτόχρονη στατιστική υποστήριξη από ανεξάρτητες μεθοδολογικές προσεγγίσεις

Meta-Analysis and Bioinformatics Detection of Susceptibility Genes in Diabetic Nephropathy

The latest meta-analysis of genome-wide linkage studies (GWLS) identified nine cytogenetic locations suggestive of a linkage with diabetic nephropathy (DN) due to type 1 diabetes mellitus (T1DM) and seven locations due to type 2 diabetes mellitus (T2DM). In order to gain biological insight about the functional role of the genes located in these regions and to prioritize the most significant genetic loci for further research, we conducted a gene ontology analysis with an over representation test for the functional annotation of the protein coding genes. Protein analysis through evolutionary relationships (PANTHER) version 16.0 software and Cytoscape with the relevant plugins were used for the gene ontology analysis, and the overrepresentation test and STRING database were used for the construction of the protein network. The findings of the over-representation test highlight the contribution of immune related molecules like immunoglobulins, cytokines, and chemokines with regard to the most overrepresented protein classes, whereas the most enriched signaling pathways include the VEGF signaling pathway, the Cadherin pathway, the Wnt pathway, the angiogenesis pathway, the p38 MAPK pathway, and the EGF receptor signaling pathway. The common section of T1DM and T2DM results include the significant over representation of immune related molecules, and the Cadherin and Wnt signaling pathways that could constitute potential therapeutic targets for the treatment of DN, irrespective of the type of diabetes

Key Genetic Components of Fibrosis in Diabetic Nephropathy: An Updated Systematic Review and Meta-Analysis

Renal fibrosis (RF) constitutes the common end-point of all kinds of chronic kidney disease (CKD), regardless of the initial cause of disease. The aim of the present study was to identify the key players of fibrosis in the context of diabetic nephropathy (DN). A systematic review and meta-analysis of all available genetic association studies regarding the genes that are included in signaling pathways related to RF were performed. The evaluated studies were published in English and they were included in PubMed and the GWAS Catalog. After an extensive literature review and search of the Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) database, eight signaling pathways related to RF were selected and all available genetic association studies of these genes were meta-analyzed. ACE, AGT, EDN1, EPO, FLT4, GREM1, IL1B, IL6, IL10, IL12RB1, NOS3, TGFB1, IGF2/INS/TH cluster, and VEGFA were highlighted as the key genetic components driving the fibrosis process in DN. The present systematic review and meta-analysis indicate, as key players of fibrosis in DN, sixteen genes. However, the results should be interpreted with caution because the number of studies was relatively small

Serpin Family E Member 1 Tag Single-Nucleotide Polymorphisms in Patients with Diabetic Nephropathy: An Association Study and Meta-Analysis Using a Genetic Model-Free Approach

Background: Many lines of evidence highlight the genetic contribution on the development of diabetic nephropathy (DN). One of the studied genes is SERPINE1 whose the role in the risk of developing DN remains questionable. In order to elucidate the contribution of SERPINE1 in DN progression in the context of type 2 diabetes mellitus (T2DM), we conducted an association study and meta-analysis of SERPINE1 genetic variants. Materials and Methods: A total of 190 patients with DN, 150 T2DM (type 2 diabetes mellitus) patients without DN and 238 healthy controls were recruited. We selected five tag single-nucleotide polymorphisms (SNPs) from the HapMap. The generalized odds ratio (ORG) was calculated to estimate the risk on DN development. Subgroup analyses based on ethnicity and type of diabetes were also performed. Results: Both the present association study regarding SERPINE1 SNPs (rs2227667, rs2070682, rs1050813, rs2227690, rs2227692) did not found any significant association between SERPINE1 variants and DN and the meta-analysis of variant 4G>5G (rs1799889) did not also reveal a significant association between 4G>5G variant and DN in main and subgroup analyses. Discussion: In conclusion, the present association study and meta-analysis provides strong evidence that SERPINE1 genetic variant 4G>5G is not implicated in the risk or development of DN in Caucasians. Further studies in other populations remain to further investigate the role of this variant in the course of DN

Serpin Family E Member 1 Tag Single-Nucleotide Polymorphisms in Patients with Diabetic Nephropathy: An Association Study and Meta-Analysis Using a Genetic Model-Free Approach

Background: Many lines of evidence highlight the genetic contribution on the development of diabetic nephropathy (DN). One of the studied genes is SERPINE1 whose the role in the risk of developing DN remains questionable. In order to elucidate the contribution of SERPINE1 in DN progression in the context of type 2 diabetes mellitus (T2DM), we conducted an association study and meta-analysis of SERPINE1 genetic variants. Materials and Methods: A total of 190 patients with DN, 150 T2DM (type 2 diabetes mellitus) patients without DN and 238 healthy controls were recruited. We selected five tag single-nucleotide polymorphisms (SNPs) from the HapMap. The generalized odds ratio (ORG) was calculated to estimate the risk on DN development. Subgroup analyses based on ethnicity and type of diabetes were also performed. Results: Both the present association study regarding SERPINE1 SNPs (rs2227667, rs2070682, rs1050813, rs2227690, rs2227692) did not found any significant association between SERPINE1 variants and DN and the meta-analysis of variant 4G>5G (rs1799889) did not also reveal a significant association between 4G>5G variant and DN in main and subgroup analyses. Discussion: In conclusion, the present association study and meta-analysis provides strong evidence that SERPINE1 genetic variant 4G>5G is not implicated in the risk or development of DN in Caucasians. Further studies in other populations remain to further investigate the role of this variant in the course of DN