Porovnání metod kapalinové chromatografie, superkritické fluidní chromatografie a hmotnostní spektrometrie s přímou infuzí

Lipidomic analysis of biological samples in a clinical research represents challenging task for analytical methods given by the large number of samples and their extreme complexity. In this work, we compare direct infusion (DI) and chromatography - mass spectrometry (MS) lipidomic approaches represented by three analytical methods in terms of comprehensiveness, sample throughput, and validation results for the lipidomic analysis of biological samples represented by tumor tissue, surrounding normal tissue, plasma, and erythrocytes of kidney cancer patients. Methods are compared in one laboratory using the identical analytical protocol to ensure comparable conditions. Ultrahigh-performance liquid chromatography/MS (UHPLC/MS) method in hydrophilic interaction liquid chromatography mode and DI-MS method are used for this comparison as the most widely used methods for the lipidomic analysis together with ultrahigh-performance supercritical fluid chromatography/MS (UHPSFC/MS) method showing promising results in metabolomics analyses. The nontargeted analysis of pooled samples is performed using all tested methods and 610 lipid species within 23 lipid classes are identified. DI method provides the most comprehensive results due to identification of some polar lipid classes, which are not identified by UHPLC and UHPSFC methods. On the other hand, UHPSFC method provides an excellent sensitivity for less polar lipid classes and the highest sample throughput within 10min method time. The sample consumption of DI method is 125 times higher than for other methods, while only 40μL of organic solvent is used for one sample analysis compared to 3.5mL and 4.9mL in case of UHPLC and UHPSFC methods, respectively. Methods are validated for the quantitative lipidomic analysis of plasma samples with one internal standard for each lipid class. Results show applicability of all tested methods for the lipidomic analysis of biological samples depending on the analysis requirements.Lipidomická analýza biologických vzorků v klinickém výzkumu představuje náročný úkol pro analytické metody. Je to dáno velkým počtem vzorků a jejich složitostí. V této práci porovnáváme přímou infuzi (DI) a chromatografii - hmotnostní spektrometrií (MS). Analytické metody jsou srovnávány z hlediska komplexnosti a výsledků validace lipidomické analýzy biologických vzorků, kterými byly nádorové tkáně, normální tkáně, plazma a erytrocyty pacientů s rakovinou ledvin. Metody jsou porovnávány v jedné laboratoři za použití stejného analytického protokolu, tak aby byly zajištěny srovnatelné podmínky. Metoda ultra-účinné kapalinové chromatografie / MS (UHPLC / MS) v režimu hydrofilní interakční chromatografie a metoda DI-MS se používají pro toto srovnání jako nejpoužívanější metody pro lipidomickou analýzu spolu s ultra-účinnou superkritickou fluidní chromatografií / MS UHPSFC / MS), která vykazuje slibné výsledky v metabolomických analýzách. Necílená analýza vzorků se provádí za použití všech uvedených metod a je identifikováno 610 lipidů v rámci 23 tříd. Metoda DI poskytuje nejkomplexnější výsledky díky identifikaci některých tříd polárních lipidů, které nejsou identifikovány metodami UHPLC a UHPSFC. Na druhou stranu metoda UHPSFC poskytuje vynikající citlivost pro méně polární třídy lipidů a nejvyšší průchodnost vzorku v průběhu doby 10 minut. Spotřeba vzorku metodou DI je 125krát vyšší než u jiných metod, zatímco pro analýzu jednoho vzorku je použito pouze 40μl organického rozpouštědla ve srovnání s 3,5mL a 4,9mL u metod UHPLC a UHPSFC. Metody jsou validovány pro kvantitativní lipidomickou analýzu vzorků plazmy s jedním vnitřním standardem pro každou třídu lipidů. Výsledky ukazují použitelnost všech testovaných metod pro lipidomickou analýzu biologických vzorků v závislosti na požadavcích analýzy

Profilování dysregulovaných sulfoglykosfingolipidů v tkáních s buněčným renálním karcinomem s využitím MALDI Orbitrap hmotnostní spektrometrie

Matrix-assisted laser desorption/ionization coupled with Orbitrap mass spectrometry (MALDI-Orbitrap-MS) is used for the clinical study of patients with renal cell carcinoma (RCC), as the most common type of kidney cancer. Significant changes in sulfoglycosphingolipid abundances between tumor and autologous normal kidney tissues are observed. First, sulfoglycosphingolipid species in studied RCC samples are identified using high mass accuracy full scan and tandem mass spectra. Subsequently, optimization, method validation, and statistical evaluation of MALDI-MS data for 158 tissues of 80 patients are discussed. More than 120 sulfoglycosphingolipids containing one to five hexosyl units are identified in human RCC samples based on the systematic study of their fragmentation behavior. Many of them are recorded here for the first time. Multivariate data analysis (MDA) methods, i.e., unsupervised principal component analysis (PCA) and supervised orthogonal partial least square discriminant analysis (OPLS-DA), are used for the visualization of differences between normal and tumor samples to reveal the most up- and downregulated lipids in tumor tissues. Obtained results are closely correlated with MALDI mass spectrometry imaging (MSI) and histologic staining. Important steps of the present MALDI-Orbitrap-MS approach are also discussed, such as the selection of best matrix, correct normalization, validation for semiquantitative study, and problems with possible isobaric interferences on closed masses in full scan mass spectra.V této práci byla použita desorpční laserová ionizicace za účasti matrice ve spojení s orbitální pastí pro klinickou studii pacientů s renálním buněčným karcinomem. Ve vzorcích ledvinové tkáně nádoru a okolní nenapadené tkáně byly nalezeny výrazné změny ve složení sulfoglykosphingolipidů. Nejprve je ve článku popsán postup identifikace jednotlivých sulfatidů s využitím vysokého rozlišení, správnosti určení hmoty a tandemové hmotnostní spektrometrie. Následně je diskutována optimalizace metody, validace a statistickévyhodnocení MALDI-MS dat pro 158 vzorků 80 pacientů

Determination of Antiviral Drugs and Their Metabolites Using Micro-Solid Phase Extraction and UHPLC-MS/MS in Reversed-Phase and Hydrophilic Interaction Chromatography Modes

Two new ultra-high performance liquid chromatography (UHPLC) methods for analyzing 21 selected antivirals and their metabolites were optimized, including sample preparation step, LC separation conditions, and tandem mass spectrometry detection. Micro-solid phase extraction in pipette tips was used to extract antivirals from the biological material of Hanks balanced salt medium of pH 7.4 and 6.5. These media were used in experiments to evaluate the membrane transport of antiviral drugs. Challenging diversity of physicochemical properties was overcome using combined sorbent composed of C18 and ion exchange moiety, which finally allowed to cover the whole range of tested antivirals. For separation, reversed-phase (RP) chromatography and hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC), were optimized using extensive screening of stationary and mobile phase combinations. Optimized RP-UHPLC separation was carried out using BEH Shield RP18 stationary phase and gradient elution with 25 mmol/L formic acid in acetonitrile and in water. HILIC separation was accomplished with a Cortecs HILIC column and gradient elution with 25 mmol/L ammonium formate pH 3 and acetonitrile. Tandem mass spectrometry (MS/MS) conditions were optimized in both chromatographic modes, but obtained results revealed only a little difference in parameters of capillary voltage and cone voltage. While RP-UHPLC-MS/MS exhibited superior separation selectivity, HILIC-UHPLC-MS/MS has shown substantially higher sensitivity of two orders of magnitude for many compounds. Method validation results indicated that HILIC mode was more suitable for multianalyte methods. Despite better separation selectivity achieved in RP-UHPLC-MS/MS, the matrix effects were noticed while using both chromatographic modes leading to signal enhancement in RP and signal suppression in HILIC