Development, optimization and applications of an analytical method for the detection and quantification of antihistamines in biological fluids using gas chromatography–mass spectrometry

Allergies are the most common pathological conditions in the modern western world, which may be acute or chronic, and occur in 15-30% of the general population. Allergic reactions are conditions where the body reacts to harmless xenobiotic substances and leads to the secretion of various mediators, especially histamine.Antihistamines, or histamine H1-receptor antagonists, are widely used in clinical practice to prevent and treat the symptoms of various acute or chronic allergic reactions by blocking the action of histamine, while some of them are used in other pathological conditions, due to their additional anticholinergic, local anesthetic, antiemetic and sedative effects. The antihistamines that are mainly used in Greece and were studied in the present PhD study are diphenhydramine, orphenadrine, dimethindene, chlorpheniramine, levocetirizine / cetirizine, hydroxyzine, meclozine, loratadine, desloratadine, rupatadine and ebastine.The aim of this PhD study was the development, optimization and validation of a suitable GC–MS methodology for the simultaneous determination of eleven antihistamines in whole blood and breast milk. The treatment procedure of the biological samples included initially precipitation of the proteins with acetonitrile, while in the case of the breast milk dilution of samples with water was performed before protein precipitation, followed by solid phase extraction and derivatization of the analytes with a mixture of acetic anhydride: n-propanol (1: 1, v/v) at 70°C for 30 minutes. The quantification of diphenhydramine, orphenadrine, chlorpheniramine, dimethindene, meclozine, loratadine, desloratadine, rupatadine and ebastine was performed using diazepam-d5 as the internal standard, while hydroxyzine-d4 and cetirizine-d8 were the corresponding internal standards for the quantification of hydroxyzine and levocetirizine, respectively. During the validation process that were performed according to the international guidelines, the parameters studied were: selectivity, specificity, linearity, limits of detection and quantification, intra- and inter-day accuracy and precision, absolute recovery of the methods, as well as the robustness of the method and the stability of analytes in spiked whole blood samples.The developed methods present considerable advantages over the already published methods using gas chromatography, in terms of the number of antihistamines analyzed, the sensitivity, the dynamic range of concentrations, but also the fact that they were fully validated.The developed method for the determination of antihistamines in whole blood was applied to real samples from clinical cases for the determination of drug levels in blood or in cases of poisoning, and to postmortem samples where one or some antihistamines were either detected in the pre-toxicology test or according to the deceased's history. These methods can also be applied to pharmacokinetic studies of these eleven antihistamines in other biological fluids, such as plasma or serum, as well as in breast milk samples in the context of investigating the excretion of antihistamines into breast milk and studies concerning their safety during breastfeeding and, consequently, their potential risk to newborns.Οι αλλεργίες αποτελούν μία από τις πιο συχνές παθολογικές καταστάσεις στο σύγχρονο δυτικό κόσμο, που μπορεί να έχουν οξύ ή χρόνιο χαρακτήρα, και εμφανίζονται σε ποσοστό από 15 έως 30% του γενικού πληθυσμού. Στις αλλεργικές αντιδράσεις ο οργανισμός αντιδρά σε αβλαβείς ξενοβιοτικές ουσίες και οδηγείται στην έκκριση διαφόρων μεσολαβητών και κυρίως της ισταμίνης.Τα αντιισταμινικά φάρμακα, ή ανταγωνιστές των Η1-υποδοχέων της ισταμίνης, χρησιμοποιούνται ευρύτατα στην κλινική πράξη με σκοπό την πρόληψη και αντιμετώπιση των συμπτωμάτων διαφόρων οξέων ή χρόνιων αλλεργικών αντιδράσεων, αναστέλλοντας τη δράση της ισταμίνης, ενώ κάποια από αυτά χρησιμοποιούνται και σε άλλες παθολογικές καταστάσεις, λόγω της επιπρόσθετης αντιχολινεργικής, τοπικής αναισθητικής, αντιεμετικής και καταπραϋντικής τους δράσης. Τα κυριότερα αντιισταμινικά φάρμακα που χρησιμοποιούνται στον Ελλαδικό χώρο και μελετήθηκαν στο πλαίσιο της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι η διφαινυδραμίνη, η ορφεναδρίνη, η διμεθινδένη, η χλωροφαινυραμίνη, η λεβοσετιριζίνη/σετιριζίνη, η υδροξυζίνη, η μεκλοζίνη, η λοραταδίνη, η δεσλοραταδίνη, η ρουπαταδίνη και η εμπαστίνη.Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η ανάπτυξη, βελτιστοποίηση και επικύρωση κατάλληλης μεθοδολογίας με GC–MS για τον ταυτόχρονο προσδιορισμό των έντεκα παραπάνω αντιισταμινικών φαρμάκων σε δείγματα ολικού αίματος και μητρικού γάλακτος. Η κατεργασία των βιολογικών δειγμάτων περιελάμβανε αρχικά καταβύθιση των πρωτεϊνών με ακετονιτρίλιο, ενώ στην περίπτωση του μητρικού γάλακτος της καταβύθισης προηγούταν αραίωση με νερό, και στη συνέχεια εκχύλιση στερεής φάσης και παραγωγοποίηση των αναλυτών με μίγμα οξικού ανυδρίτη:n-προπανόλης (1:1, v/v) στους 70oC για 30 λεπτά. Για τον ποσοτικό προσδιορισμό της διφαινυδραμίνης, της ορφεναδρίνης, της χλωροφαινυραμίνης, της διμεθινδένης, της μεκλοζίνης, της λοραταδίνης, της δεσλοραταδίνης, της ρουπαταδίνης και της εμπαστίνης χρησιμοποιήθηκε η διαζεπάμη-d5 ως εσωτερικό πρότυπο, ενώ η υδροξυζίνη-d4 και η σετιριζίνη-d8 αποτέλεσαν εσωτερικά πρότυπα για τον προσδιορισμό της υδροξυζίνης και της λεβοσετιριζίνης, αντίστοιχα. Κατά την επικύρωση των μεθόδων που αναπτύχθηκαν, η οποία πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τις διεθνείς κατευθυντήριες οδηγίες, οι παράμετροι που μελετήθηκαν ήταν οι εξής: εκλεκτικότητα, ειδικότητα, γραμμικότητα, κατώτατο όριο ανίχνευσης και ποσοτικοποίησης, επαναληψιμότητα, ενδοεργαστηριακή αναπαραγωγιμότητα, ορθότητα εντός την ημέρας και διά των ημερών, απόλυτη ανάκτηση σε ολικό αίμα και μητρικό γάλα, καθώς και η ανθεκτικότητα και η σταθερότητα των αναλυτών σε εμβολιασμένα δείγματα ολικού αίματος.Οι αναπτυχθείσες μέθοδοι παρουσιάζουν σημαντικά πλεονεκτήματα έναντι των ήδη δημοσιευμένων μεθόδων που χρησιμοποιούν αέρια χρωματογραφία, όσον αφορά στον αριθμό των αντιισταμινικών που αναλύονται, την ευαισθησία, το δυναμικό εύρος συγκεντρώσεων, αλλά και της πλήρους επικύρωσής τους.Η αναπτυχθείσα μέθοδος σε ολικό αίμα εφαρμόσθηκε σε δείγματα από κλινικά περιστατικά που αφορούσαν σε έλεγχο των επιπέδων των φαρμάκων ή σε περιπτώσεις δηλητηριάσεων, αλλά και σε μεταθανάτια δείγματα όπου κάποιο ή κάποια αντιισταμινικά φάρμακα είτε ανιχνεύθηκαν κατά τον προκαταρκτικό τοξικολογικό έλεγχο, είτε η λήψη τους ήταν γνωστή από το ιστορικό του θανόντος. Οι μέθοδοι αυτές μπορούν, επίσης, να εφαρμοσθούν σε φαρμακοκινητικές μελέτες των έντεκα αυτών αντιισταμινικών φαρμάκων σε βιολογικά υλικά, όπως πλάσμα ή ορός, αλλά και σε δείγματα μητρικού γάλακτος στο πλαίσιο διερεύνησης της απέκκρισης των αντιισταμινικών φαρμάκων στο εν λόγω βιολογικό υλικό και σε μελέτες σχετικά με την ασφάλεια του θηλασμού και την πιθανή επικινδυνότητά τους στο νεογνό