Arbutin production via biotransformation of hydroquinone in in vitro cultures of Aronia melanocarpa (Michx.) Elliott

Arbutin (hydroquinone β-D-glucoside) is a compound of plant origin possessing valuable therapeutic (urinary tract disinfection) and cosmetic (skin whitening) properties, which can be obtained from in vitro cultures of plants belonging to different taxa via biotransformation of exogenously supplemented hydroquinone. Agitating cultures of Aronia melanocarpa were maintained on the Murashige and Skoog medium containing growth regulators: the cytokinin - BAP (6-benzylaminopurine), 2 mg/l and the auxin NAA (α-naphthaleneacetic acid), 2 mg/l. The biomass was cultured for 2 weeks and then hydroquinone was supplemented at the following doses: 96, 144, 192, 288 and 384 mg/l either undivided or divided into two or three portions added at 24-hour intervals. The content of the reaction product - arbutin, was determined using an HPLC method in methanolic extracts from biomass and lyophilized medium samples collected 24 hours after the addition of the last precursor dose. The total amounts of arbutin were very diverse, from 2.71 to 8.27 g/100g d.w. The production of arbutin rose with increasing hydroquinone concentration. The maximum content of the product was observed after hydroquinone addition at 384 mg/l divided into two portions. Biotransformation efficiency also varied widely, ranging from 37.04% do 73.80%. The identity of the product - arbutin, after its isolation and purification was confirmed by spectral analysis (1H-NMR spectrum). The maximum amount of arbutin obtained was higher than that required by the latest 9th Edition of the Polish Pharmacopoeia and by the newest 8th Edithion of European Pharmacopoeia for Uvae ursi folium (7.0 g/100g d.w.), and is interesting from practical point of view

Optimization of biotransformation of hydroquinone to arbutin by Aronia melanocarpa (Michx.) Elliott in vitro cultures

Wstępne badania prowadzone w Katedrze Botaniki Farmaceutycznej Collegium Medicum Uniwersytetu Jagiellońskiego wykazały zdolność kultur in vitro Aronia melanocarpa do przeprowadzania biotransformacji hydrochinonu w arbutynę. Celem niniejszych badań była optymalizacja tego procesu poprzez określenie wpływu dawki i sposobu podania prekursora na jego przebieg.Kultury wytrząsane Aronia melanocarpa prowadzono na podłożu Murashige-Skoog (MS) z dodatkiem 2 mg/l BAP oraz 2 mg/l NAA jako regulatorów wzrostu. Po 2-tygodniowym okresie wzrostu biomasy do prowadzonych kultur dodawano hydrochinon w następujących ilościach: 96, 144, 192, 288 i 384 mg/l, w dawce jednorazowej oraz podzielonej na dwie i trzy porcje dodawane w 24-godzinnych odstępach czasowych. Materiał do badań pobierano po upływie 24 godzin od dodania ostatniej porcji prekursora. Identyfikacji arbutyny dokonano na podstawie analizy HPLC i TLC jej metanolowych ekstraktów z suchej biomasy oraz liofilizowanych pożywek, a po wyizolowaniu związku także na podstawie widma 1H NMR. Analizy ilościowej dokonano metodą HPLC.Całkowita zawartość arbutyny wahała się od 2,71 - 8,27 g/100g s.m. Biosynteza arbutyny wzrastała wraz ze zwiększającymi się stężeniami hydrochinonu, a jego porcjowanie było czynnikiem sprzyjającym biotransformacji. Arbutyna była gromadzona głównie w hodowanej biomasie, jednak analiza składu pożywki wykazała obecność jej znaczących ilości w przypadku suplementacji wyższymi stężeniami hydrochinonu – 288 mg/l i 384 mg/l. Biotransformacja przebiegała ze średnią wydajnością 37,04% - 73,80%. Wraz ze wzrastającymi stężeniami hydrochinonu odnotowano spadek wydajności, natomiast dzielenie hydrochinonu na porcje okazało się wpływać korzystnie na wydajność procesu. Uzyskane wyniki są interesujące z praktycznego punktu widzenia.Preliminary studies conducted in the Chair of Pharmaceutical Botany, Jagiellonian University Medical College demonstrated the ability of Aronia melanocarpa in vitro cultures to carry out the hydroquinone biotransformation into arbutin. The aim of this study was to optimize this process by evaluation of the precursor dose and the effects of the method of precursor administration on its course.Agitated cultures of Aronia melanocarpa were cultured on the Murashige-Skoog (MS) medium with the addition of 2 mg/l BAP and 2 mg/l NAA as growth regulators. After a two-week biomass growth period, the cultures were supplemented with hydroquinone in the following amounts: 96, 144, 192, 288 and 384 mg/l, as a single dose and divided into two or three portions administered at 24-hour intervals. Samples were collected 24 hours after addition of the last portion of the precursor. Arbutin identification was based on HPLC and TLC analysis of the methanol extract from freeze-dried biomass and culture medium and on 1H NMR spectrum after product purification. Quantitative analysis was performed by HPLC.The total content of arbutin ranged from 2.71 – 8.27 g/100g d.w. Arbutin production increased with increasing concentrations of hydroquinone and division of its dose contributed to biotransformation. Arbutin was collected mainly from grown biomass but the analysis of medium composition showed its presence in significant quantities at higher hydroquinone concentrations (288 mg/l and 384 mg/l). Biotransformation proceeded with an average yield of 37.04% - 73.80%. Efficiency decreased with increasing concentrations of hydroquinone and division of its dose into portions was found to positively affect the yield of the process. The results are interesting from a practical point of view