Xylosyltransferase-I Regulates Glycosaminoglycan Synthesis during the Pathogenic Process of Human Osteoarthritis

Loss of glycosaminoglycan (GAG) chains of proteoglycans (PGs) is an early event of osteoarthritis (OA) resulting in cartilage degradation that has been previously demonstrated in both huma and experimental OA models. However, the mechanism of GAG loss and the role of xylosyltransferase-I (XT-I) that initiates GAG biosynthesis onto PG molecules in the pathogenic process of human OA are unknown. In this study, we have characterized XT-I expression and activity together with GAG synthesis in human OA cartilage obtained from different regions of the same joint, defined as “normal”, “late-stage” or adjacent to “late-stage”. The results showed that GAG synthesis and content increased in cartilage from areas flanking OA lesions compared to cartilage from macroscopically “normal” unaffected regions, while decreased in “late-stage” OA cartilage lesions. This increase in anabolic state was associated with a marked upregulation of XT-I expression and activity in cartilage “next to lesion” while a decrease in the “late-stage” OA cartilage. Importantly, XT-I inhibition by shRNA or forced-expression with a pCMV-XT-I construct correlated with the modulation of GAG anabolism in human cartilage explants. The observation that XT-I gene expression was down-regulated by IL-1β and up-regulated by TGF-β1 indicates that these cytokines may play a role in regulating GAG content in human OA. Noteworthy, expression of IL-1β receptor (IL-1R1) was down-regulated whereas that of TGF-β1 was up-regulated in early OA cartilage. Theses observations may account for upregulation of XT-I and sustained GAG synthesis prior to the development of cartilage lesions during the pathogenic process of OA

Réactivité de métabolites d'acides carboxyliques (acylglucuronides, acyl CoA) avec les UDP-glucuronosyltransférases (étude mécanistique et implications pharmacologiques)

NANCY1-SCD Pharmacie-Odontologie (543952101) / SudocPARIS-BIUP (751062107) / SudocSudocFranceF

Etudes mécanistiques, structurales et fonctionnelles des UDP-glucuronosyltransférases impliquées dans la conjugaison des phénols et catéchols

Les UDP-glucuronosyltransférases (UGTs) représentent une famille multigénique d'enzymes responsables de la biotransfoIination de substances exogènes (médicaments) et endogènes comme la bilirubine. Ces enzymes sont principalement hépatiques mais leur présence est également détectée au niveau d'autres organes comme, le cerveau, la peau, la muqueuse nasale ou le tractus gastro-intestinal. Dans le cadre d'une étude structure fonction de ces enzymes chez l'homme et le rat, afin de mieux comprendre les évènements moléculaires de la glucuronoconjugaison, nous avons utilisé une série de molécules, les catéchols, pour explorer le site actif des UGTs. Ces composés de structures différentes contiennent cependant un motif commun, le l,2-dihydroxybenzene. Les catéchols présentent des propriétés pharmacologiques et toxicologiques diverses et sont pour certains impliqués dans des processus physiologiques majeurs. La première partie de notre travail a consisté à mettre au point et développer des modèles prédictifs de prise en charge de ces substances par les UGTs hépatiques chez l'homme et le rat. Ces modèles visent à évaluer précocement le métabolisme, la toxicité et les possibles interférences médicamenteuses de nouvelles molécules catéchols à visée thérapeutique. Nous avons déterminé les paramètres stériques et électroniques caractérisant ces catéchols importants pour la catalyse, et identifié les UGT impliquées (UGT1A6, 2B1,1A9 en particulier). Dans une deuxième partie, nous avons mis en évidence une glucuronoconjugaison des catéchols au niveau du tractus gastro-intestinal. Pour certains composés la prise en charge par les UGTs est plus importante qu'aù niveau du foie, ce qui suggère une contribution importante de cet organe dans le métabolisme de ces substances. Enfin, dans une troisième partie, nous nous sommes plus particulièrement intéressés à la mécanistique de la glucuronoconjugaison des catéchols et des phénols par l'isoforme humaine UGT1A6 en identifiant les acides aminés cruciaux pour la catalyse. Par une stratégie de mutagenèse dirigée associée à l'utilisation d'agents de modification chimique, nous avons analysé le rôle de plusieurs résidus histidine. Après génération et expression des isoformes d'UGTlA6 sauvage et mutées dans la levure Pichia pastoris, l'histidine en position 370 a été identifié comme un des résidus catalytiques. D'autres résidus histidine jouent des rôles importants dans la structure ou l'interaction avec le co-substrat, l'acide UDP-glucuronique. Sur la base de ces résultats, dès mécanismes réactionnels pour la glucuronoconjugaison des phénols et des catéchols ont été proposés.En conclusion, les résultats de notre travail contribuent à mieux comprendre les phénomènes qui régissent la glucuronoconjugaison des catéchols chez l'homme et le rat.NANCY1-SCD Pharmacie-Odontologie (543952101) / SudocSudocFranceF

Études structurales et fonctionnelles des UDP-glucuronosyltransférases humaines de la Famille 1A

L UGT1A6 humaine appartient à la famille multigénique des UDP-glucuronosyltransférases (UGTs) qui sont responsables de la biotransformation des xénobiotiques et des substances endogènes. Cette isoforme joue un rôle important en pharmaco-toxicologie car elle est impliquée dans la métabolisation de médicaments et de substances phénoliques polycycliques. L UGT1A6 catalyse le transfert de l acide glucuronique, à partir du substrat donneur l acide UDP-a-D-glucuronique, sur des phénols accepteurs hydrophobes. Le mécanisme réactionnel postulé est de type SN2 et fait appel à une base catalytique capable d activer l accepteur par déprotonation. Il s ensuit une attaque nucléophile sur le carbone 1 de l acide glucuronique et conduit à la formation d un ß-D-glucuronide hydrosoluble avec inversion de configuration et libération d UDP facilitée par la présence d un cation magnésium. Le but de notre travail est d identifier les acides aminés qui sont impliqués dans la catalyse enzymatique et dans la reconnaissance des substrats. Nous avons cherché dans un premier temps la base catalytique. Le rôle des 15 acides aminés aspartique / glutamique hautement conservés de toute la séquence codante de l UGT1A6 humaine a été évalué par mutagenèse dirigée systématique, modification chimique et modélisation par homologie avec les glycosyltransférases dont la structure 3-D est résolue. Nous avons montré que, sauf pour les résidus aspartique Asp150 et Asp488, la substitution des résidus carboxyliques par alanine a conduit à des mutants actifs mais présentant une diminution de l activité enzymatique et une baisse d affinité pour le substrat accepteur et / ou le substrat donneur. En outre, la comparaison de séquences des UGTs et l homologie avec les glycosyltransférases suggèrent que l Asp150 joue un rôle de base catalytique. Dans un second temps, nous avons identifié l acide aminé (His38) de l UGT1A6 comme résidu pivot dans la reconnaissance des substrats accepteurs. L étude a tiré profit de l existence de 2 isoformes présentant 93% d homologie et des spécificités de substrats très différentes : l UGT1A4 qui métabolise que des amines et l UGT1A3 qui métabolise les phénols, acides carboxyliques mais pas les amines. La comparaison de séquences de la famille UGT1A fait apparaître un résidu histidine très conservé dans toute les isoformes, sauf dans l UGT1A4 ou il est remplacé par une proline. La substitution de Pro40 de l UGT1A4 par His élargit l activité enzymatique aux composés phénoliques et carboxyliques (spécificité de type UGT1A3). Inversement, lorsque le résidu His40 de l UGT1A3 est remplacé par la proline, cette isoforme conjugue les amines et pas les phénols et acides carboxyliques, comme l UGT1A4. Cette étude constitue une avancée importante sur la compréhension des mécanismes moléculaires de la glucuronoconjugaison des xénobiotiques et des médicaments. Enfin, dans une dernière partie nous avons entrepris une étude visant à établir la panoplie des UGTs présentes dans les cellules chondrocytaires articulaires chez l homme qui sont la cible de médicaments de type anti-inflammatoires non stéroïdiens carboxyliques et d estrogènes connus pour affecter l homéostasie du cartilage. Les résultats montrent que plusieurs isoformes sont présentes à l état de transcrits, à des niveaux très faibles, ne permettant pas pour l instant de les caractériser par immunodosage ou par mesure de l activité enzymatique.The human UDP-glucuronosyltransferase UGT1A6 is the primary phenol-metabolizing UGT isoform. It catalyzes the nucleophilic attack of phenolic xenobiotics on UDP-glucuronic acid, leading to the formation of water-soluble glucuronides. The catalytic mechanism proposed for this reaction is an acid-base mechanism that involves an aspartic/glutamic acid and/or histidine residue. Here, we investigated the role of fifteen highly conserved aspartic/glutamic acid residues over the entire sequence of human UGT1A6 by site-directed mutagenesis. We showed that, except for aspartic residues D150 and D488, the substitution of carboxylic residues by alanine led to active mutants but with decreased enzyme activity and lower affinity for acceptor and/or donor substrate. Further analysis including mutation of the corresponding residue in other UGT1A isoforms suggests that D150 play a major catalytic role. In this report, we also identified a single active site residue important for glucuronidation of phenols and carboxylic acid substrates by UGT1A enzyme family. Replacing P40 of UGT1A4 by histidine expanded the glucuronidation activity of the enzyme to phenolic and carboxylic compounds, therefore leading to UGT1A3-type isoform in terms of substrate specificity. Conversely, when H40 residue of UGT1A3 was replaced with proline, the substrate specificity shifted toward that of UGT1A4 with loss of glucuronidation of phenolic substrates. Furthermore, mutation of H39 residue of UGT1A1 (H40 in UGT1A4) to proline led to loss of glucuronidation of phenols but not of estrogens. This study provides a step forward to better understand the glucuronidation mechanism and substrates recognition, which is invaluable for a better prediction of drug metabolism and toxicity in human. In the last part of the work, we determined the UGT isoforms that are expressed in human articular chondrocytes, and which are involved in the glucuronidation of nonsteroidal anti-inflammatory drugs and estrogens known to affect cartilage homeostasy. The results showed that several isoforms were indeed expressed as a transcript, but at a very low level, making the characterisation of the enzyme via their activity or immunodosage unsuccessful.NANCY1-Bib. numérique (543959902) / SudocSudocFranceF

Étude des propriétés de deux séries de substances d'origine naturelle (les cucurbitacines et les parabènes)

Les cucurbitacines et les parabènes sont des substances d'origine naturelle appartenant à la famille des triterpéniques cycliques et des esters de l'acide-hydroxybenzoïque, respectivement. Ils sont connus pour posséder chez l'homme plusieurs effets pharmacologiques potentiellement intéressants. Le but de ce travail est d'étudier la biotransformation d'une série de trois cucurbitacines et de cinq parabènes dans le foie humain in vitro, essentiellement par glucuronoconjugaison et hydrolyse et caractériser l'effet cytotoxique des cucurbitacines sur une lignée cellulaire du chondrosarcome humain SW 1353. Les résultats ont montré que les cucurbitacines I et D sont plus cytotoxiques que la cytochalasine D vis-à-vis SW 1353 et entraînent l'apoptose des cellules après 12h de traitement à 1 M alors que la cucurbitacine E présente une cytotoxicité à 10 M. L'étude in vitro de biotransformation chez l'homme montre que les cucurbitacines sont surtout sulfo- et glucuronoconjuguées (méthodes radiochimiques) par les isoformes de la famille 1A essentiellement. La cucurbitacine E est également activement hydrolysées (Km 22 M et Vmax 571 nmol/mg /min) en cucurbitacine I dans le foie humain. Par contre, ces substances sont très faiblement hydroxylées. Les acides oléanolique, ursolique et l'érythrodiol, de structure apparentée aux cucurbitacines, sont aussi glucuronoconjuguées au même taux dans les microsomes hépatiques humains mais avec des affinités 100 fois plus élevées. Les parabènes sont rapidement hydrolysés par des estérases dans les microsomes hépatiques humains en acide 4-hydroxybenzoïque, et leur hydrolyse diminue avec la longueur de la chaîne alkyle. Les parabènes, l'acide caféique, le tyrosol et l'hydroxytyrosol, de structure apparentée aux parabènes, sont activement glucuronoconjuguées par les UGTs des familles 1A et 2B. Cependant, l?acide 4-hydroxybenzoïque n'est pas un bon substrat pour les UGTsCucurbitacins and parabens are natural compounds belonging to cyclic triterpenoid and alkyl ester of 4-hydroxybenzoic acid, respectively. They are known for their potential valuable pharmacological effects. The aim of this work was to study the biotransformation of a series of three cucurbitacins and six parabens in human liver, in vitro, essentially by glucuronidation and hydrolysis reactions, and by comparision with other natural substances structurally related, and to characterize the cytotoxicity effect of cucurbitacins on a human chondrosarcoma cell line, SW 1353. The results showed that cucurbitacins I and D showed more cytotoxicity than cytochalasin D and led to cell apoptosis after 12h of treatment at 1 ?M. Cucurbitacin E showed its cytotoxic effect at 10 M. The in vitro study of cucurbitacins biotransformation in man showed that these substances are sulfated, glucuronidated (radiochemical methods). Moreover, cucurbitacin E was actively hydrolyzed (Km 22 M and Vmax 571 nmol/mg protein/min) leading to cucurbitacin I in man liver. On the other hand, they are weakly hydroxylated. Oleanolic acid, ursolic acid and erythrodiol, chemically related to cucurbitacins, were glucuronidated at the same rate in human liver microsomes, however, with affinities 100 times greater. Parabens were quickly hydrolyzed in human liver microsomes by esterases and hydrolysis decreased with side chain length. Parabens, caffeic acid, tyrosol and hydroxytyrosol were actively glucuronidated by the UGTs of both families 1A and 2B. However, p-hydroxybenzoic acid is not a good substrate for UGTsMETZ-SCD (574632105) / SudocNANCY1-Bib. numérique (543959902) / SudocNANCY2-Bibliotheque electronique (543959901) / SudocNANCY-INPL-Bib. électronique (545479901) / SudocSudocFranceF

L'agrécane et le cartilage articulaire : apport des glycosyltransférases dans la réparation du cartilage arthrosique

L'arthrose, la maladie la plus fréquente du système musculo-squelettique, est la conséquence de processus mécaniques et biologiques qui rompent l'homéostasie du cartilage, de la synoviale et de l'os sous-chondral. Dans le but de développer de nouvelles thérapeutiques efficaces, visant à restaurer la matrice cartilagineuse, nous caractérisons les mécanismes moléculaires et les protéines-clés responsables de l'initiation de la maladie. Un des évènements les plus précoces est la dégradation de l'agrécane qui est le protéoglycane matriciel le plus abondant. Les chaînes de chondroïtine sulfate liées à la protéine porteuse sont découpées en petits fragments. Le laboratoire s'intéresse aux glycosyltransférases qui catalysent la formation des chaînes polysaccharidiques, en particulier celles impliquées dans la synthèse de l'amorce tétrasaccharidique commune de liaison à la protéine porteuse, GlcA$\beta$1,3Galβ1,3Gal$\beta$1,4Xyl-O-Sérine. La galactose β1,3-glucuronosyltransférase-I (GlcAT-I), qui attache l'acide glucuronique terminal et qui est fortement réprimée durant l'arthrose, est une cible potentiellement intéressante. En effet, l'enzyme recombinante humaine joue un rôle primordial dans la synthèse des glycosaminoglycanes (GAG). La surexpression de la GlcAT-I dans des explants de cartilage traités par l'IL1$\beta$ est capable de s'opposer complètement à la déplétion en protéoglycanes provoquées par cette cytokine pro-inflammatoire. Des études structure/fonction/régulation de cette enzyme ont alors été entreprises. Les résultats constituent les bases pour le développement de plusieurs thérapeutiques basées sur la vectorisation de gènes en intra-articulaire et la conception de glycomimétiques capables de réparer le cartilage