Increasing productivity of arylsulfatase B-producing cell line by coexpression of formylglycine-generating enzyme

Mucopolysaccharidosis type VI (Maroteaux–Lamy syndrome) is an orphan genetic disease caused by deficiency of the lysosomal enzyme arylsulfatase B (ASB). The need to develop a highly productive cell line for the production of recombinant ASB, is behind the concept and relevance of this study. The most promising approach seems to be the development of CHO producer cell lines coexpressing the target ASB enzyme and an auxiliary formylglycine-generating enzyme (FGE). At the same time, it is important from a practical perspective to have the possibility of cultivating producer cell lines as suspensions free of serum or other components of animal origin. The aim of the study was to develop highly productive cell lines for the production of recombinant ASB by coexpression of the auxiliary FGE. Materials and methods: a suspension CHO cell line was used in the study. CHO cells were transfected by electroporation using the MaxCyte STX system. Monoclonal cell lines were obtained with the help of the Cell Metric system. Enzyme-linked immunosorbent assay was used for determination of ASB concentration in the culture fluid. Culture fluid samples were analysed using polyacrylamide gel electrophoresis and Western blotting. The mRNA level was measured by real-time polymerase chain reaction. Results: producer cell lines coexpressing the target ASB enzyme and auxiliary FGE were obtained. An increase in the yield of the active target ASB enzyme from 2 to 100 mg/L was achieved by selecting the optimal ratio of plasmids during transfection. The highest yield of the target ASB enzyme was achieved at the 90:10 ratio (%) of plasmids encoding the ASB and FGE genes, respectively. Conclusions: the authors developed highly productive cell lines for the production of recombinant ASB, which coexpress the target and auxiliary enzymes. The coexpression of ASB and FGE improves the growth and production characteristics of the cell line, probably due to the modification of the ASB active site. The obtained results will help resolve the problem of low enzyme yield, which is typical of this class of medicines

Optimisation of culture conditions for a producer clone coexpressing arylsulfatase B and a formylglycine-generating enzyme in order to increase the yield of arylsulfatase B

Maroteaux—Lamy syndrome (mucopolysaccharidosis type VI) is an orphan genetic disease caused by mutations in the arylsulfatase B gene (ARSB), which encodes the lysosomal enzyme arylsulfatase B (ASB). The relevance of the study lies in the need of a Russian recombinant ASB product for patients with the disease in the Russian Federation. Previously, the authors have developed producer lines coexpressing the target ASB enzyme with an auxiliary formylglycine-generating enzyme (FGE), based on Chinese hamster ovary (CHO) cells. Further development of the recombinant ASB preparation places priority on increasing the enzyme yield. The aim of this study was to increase the productivity of producer clones by optimising the culture process and adding calcium chloride and copper sulfate to the culture medium. Materials and methods: a suspension-adapted CHO cell line was used. Monoclonal cell lines were developed using Cell Metric and ClonePix FL systems. The concentration of ASB in the culture liquid was determined using the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The authors analysed batch culture and/or fed-batch culture in media supplemented with various concentrations of copper sulfate and calcium chloride. Results: the combined addition of copper sulfate and calcium chloride at concentrations of 300 μM during batch culture of producer clones coexpressing ASB and FGE increases viability and specific productivity of the cells up to 4.58±1.62 pg/ (cell×day). The cultivation of the lead producer clone coexpressing ASB and FGE under fed-batch conditions for 12 days and the addition of copper sulfate to the growth medium at the concentration of 300 μM allow for increasing the yield of the active lysosomal enzyme, arylsulfatase B, to 420 mg/L. Conclusions: the cultivation of producer clones coexpressing ASB and FGE under fed-batch conditions with copper sulfate added to the medium significantly improves cell line growth properties and the ASB yield. This approach to the selection of culture conditions for producer cell lines can be applied to other enzymes of the sulfatase family

Интернализация рекомбинантной имиглюцеразы в перитонеальные макрофаги мыши и фибробласты мыши линии L929

Enzyme replacement therapy (ERT) is one of the most efficient treatments for lysosomal storage diseases. Type 1 Gaucher disease is caused by β-glucocerebrosidase enzyme deficiency, which may be compensated for by intravenous infusions of imiglucerase—a recombinant enzyme. Imiglucerase targets macrophages and enters these cells via interaction with mannose receptors on the cell membrane. Characterisation of internalization of enzymes by target cells is important in the context of the development of new medicines and production of existing ERT medicines. The peritoneal and alveolar macrophages, as well as macrophages of the spleen of small laboratory animals (rats and mice) are widely used in such studies. However, isolation of cells from animal sources raises ethical issues, and therefore continuous mammalian cell lines may offer an attractive alternative. The aim of the study: to conduct comparative studies on the internalization of recombinant imiglucerase into mouse peritoneal macrophages and L929 mouse fibroblasts. Materials and methods: CerezymeR batches 7HV0913, C6214H05, 7HV0888 (Genzyme Ltd., UK); Glurazim batches 020416, 011117, 021117 (LLC “IBC “Generium”, Russia). We used peritoneal macrophages obtained from BALB/c mice and L929 mouse fibroblasts. The cells were cultured in DMEM/F12 complete growth medium with 10% fetal bovine serum. The activity of imiglucerase internalized into the cells was evaluated spectrophotometrically by hydrolysis of the artificial substrate—4-methylumbelliferyl-β-Dglucopyranoside. Results: the study compared internalization of recombinant imiglucerase (the active ingredient of CerezymeR and Glurazim) by mouse peritoneal macrophages and L929 mouse fibroblasts. It was demonstrated that the medicines activity in the lysates of peritoneal macrophages is comparable with that in the lysates of L929 mouse fibroblasts. Regardless of the model system, the activity of Glurazim stayed within the acceptable range (80–125%) established for biosimilar products. Conclusions: the experiments proved that L929 mouse fibroblasts could be recommended for assessment of internalization of recombinant imiglucerase.Фермент-заместительная терапия (ФЗТ) является одной из самых действенных при лечении болезней лизосомального накопления. Болезнь Гоше первого типа характеризуется недостатком нативного фермента β-глюкоцереброзидазы, который возмещают внутривенными инфузиями рекомбинантного фермента (имиглюцераза). Клетками-мишенями имиглюцеразы являются макрофаги, в которые фермент проникает посредством взаимодействия с рецепторами маннозы на клеточной мембране. Оценка интернализации ферментов клетками-мишенями представляет интерес при разработке новых и воспроизведении существующих препаратов для ФЗТ. Для этих исследований широко применяются перитонеальные и альвеолярные макрофаги, макрофаги селезенки мелких лабораторных животных (крыс и мышей). Однако получение таких клеток затрагивает этические вопросы использования лабораторных животных. Альтернативой являются перевиваемые клеточные линии млекопитающих. Цель работы: провести сравнительные исследования интернализации рекомбинантной имиглюцеразы в перитонеальные макрофаги мыши и фибробласты мыши линии L929. Материалы и методы: Церезим®, серии 7HV0913, C6214H05, 7HV0888 (Джензайм Лтд., Великобритания); Глуразим, серии 020416, 011117, 021117 (ООО «МБЦ «Генериум», Россия). В работе использовали перитонеальные макрофаги, полученные от мышей линии BALB/c, и фибробласты мыши линии L929. Клетки культивировали в полной ростовой среде ДМЕМ/Ф12 c добавлением 10% сыворотки плода крупного рогатого скота. Активность имиглюцеразы, проникшей в клетки, оценивали спектрофотометрически по гидролизу искусственного субстрата 4-метилумбеллиферил-β-D-глюкопиранозида. Результаты: представлены данные сравнительной оценки интернализации рекомбинантной имиглюцеразы, действующего вещества препаратов Церезим® и Глуразим, перитонеальными макрофагами мыши и клетками фибробластов мыши линии L929. Показано, что активность препаратов в лизатах перитонеальных макрофагов сопоставима с их активностью в лизатах клеток фибробластов мыши линии L929, при этом активность разработанного препарата Глуразим независимо от типа клеток, была в границах допустимого диапазона (80–125%), установленного для биоподобных препаратов. Выводы: экспериментально доказано, что фибробласты мыши линии L929 могут быть рекомендованы для оценки интернализации рекомбинантной имиглюцеразы

Физико-химические и биологические свойства биоподобного и референтного препаратов тканевого активатора плазминогена

Recombinant tissue plasminogen activator (international nonproprietary name — alteplase) which was developed by «GENERIUM» (Russia) and received a marketing authorisation in Russia is completely analogous to Actilyse® which is used to treat medical conditions accompanied by thrombosis, such as acute myocardial infarction, pulmonary embolism, and ischemic stroke. The aim of the study was to carry out a comprehensive comparison of physico-chemical and biological properties of Revelyse® and the reference product Actilyse® in order to assess their biosimilarity. Materials and Methods: comparative peptide mapping and determination of comparability of chromatographic profiles of tryptic hydrolysates was performed using RP-HPLC and massspectrometry; the molecular weight distribution was determined by mass-spectrometry and polyacrylamide gel electrophoresis (Laemmli method). The purity and homogeneity of products as well as the content of related impurities (oligomers and fragments) were determined using gel filtration; N-glycosylation profile was analysed by hydrophilic HPLC, total sialic acid was quantified by the Svennerholm resorcinol method. Protein binding to fibrin and human fibrinogen was assessed by surface plasmon resonance, and the specific activity was compared by fibrin clot lysis. Results: the research demonstrated a complete overlap of the products’ peptide maps, which indicates the identity of аlteplase amino acid sequences in the two medicines being compared. The authors of the study also determined the molecular weight and the content of the intact single-stranded form of the protein, and quantified post-translational modifications, the content of sialic acids and neutral sugars. The analysis of the N-glycosylation profile revealed insignificant differences in the percentage of multiantenna complex glycans. The specificity of alteplase was evaluated by analysing the formation of protein complexes with natural alteplase ligands – fibrin and plasminogen activator inhibitor-1, but no significant differences were found. The comparison of specific activation of plasminogen fibrinolytic activity was performed based on the results of the assay analysing the fibrin clot lysis rate, and it demonstrated comparability of Revelyse® and Actilyse®. Conclusions: comparative experimental studies have shown no differences in the structure, charge distribution heterogeneity, impurities content, and specific activity of alteplase as a component of Revelyse® and the reference product Actilyse®, which leads to the conclusion that they are similar in terms of physicochemical and biological properties.Рекомбинантный тканевой активатор плазминогена (международное непатентованное название — алтеплаза), разработанный и зарегистрированный компанией АО «ГЕНЕРИУМ» (Россия), является полным аналогом лекарственного препарата Актилизе®, используемого для лечения заболеваний, сопровождающихся тромбообразованием, таких как инфаркт миокарда, тромбоэмболия легочной артерии и ишемический инсульт. Цель работы: провести комплексное исследование сопоставимости физико-химических и биологических характеристик лекарственного препарата Ревелиза® и референтного препарата Актилизе® для оценки их биоподобия. Материалы и методы: сравнительное пептидное картирование с определением сопоставимости хроматографических профилей триптических гидролизатов проводилось методами ОФ-ВЭЖХ и масс-спектрометрии, определение молекулярно-массового распределения — методами масс-спектрометрии и электрофореза в полиакриламидном геле по Леммли. Для определения чистоты и гомогенности препаратов, а также содержания родственных примесей (олигомеров, фрагментов) использовали метод гель-фильтрации; исследование профиля N-гликозилирования осуществляли методом гидрофильной ВЭЖХ, определение тотального содержания сиаловых кислот — методом Свеннерхольма. Оценку связывания белка с фибрином и фибриногеном человека проводили методом поверхностного плазмонного резонанса, сравнение специфической активности — методом лизиса фибринового сгустка. Результаты: в ходе исследований было продемонстрировано полное совпадение пептидных карт анализируемых препаратов, что свидетельствует об идентичности аминокислотной последовательности алтеплазы в составе сравниваемых препаратов. Также сравнительно были определены молекулярная масса и содержание интактной одноцепочечной формы белка в лекарственных препаратах, количественно охарактеризованы посттрансляционные модификации, содержание сиаловых кислот и нейтральных сахаров. При изучении профиля N-гликозилирования обнаружены незначительные различия в процентном содержании мультиантенных комплексных гликанов. Специфичность алтеплазы оценивали при образовании белковых комплексов с природными лигандами алтеплазы — фибрином и ингибитором активатора плазминогена первого типа, при этом достоверных различий обнаружено не было. При сравнении специфической активации фибринолитической активности плазминогена в тесте на скорость лизиса фибринового сгустка была продемонстрирована сопоставимость препаратов Ревелиза® и Актилизе®. Выводы: проведенные сравнительные экспериментальные исследования показали отсутствие различий в структуре, гетерогенности распределения зарядов, содержании примесей, а также специфической активности алтеплазы в составе лекарственного препарата Ревелиза® и референтного препарата Актилизе®, что позволяет сделать вывод о сопоставимости препаратов по физико-химическим и биологическим свойствам

Увеличение продуктивности клеточной линии-продуцента арилсульфатазы B за счет коэкспрессии формилглицин-генерирующего фермента

Mucopolysaccharidosis type VI (Maroteaux–Lamy syndrome) is an orphan genetic disease caused by deficiency of the lysosomal enzyme arylsulfatase B (ASB). The need to develop a highly productive cell line for the production of recombinant ASB, is behind the concept and relevance of this study. The most promising approach seems to be the development of CHO producer cell lines coexpressing the target ASB enzyme and an auxiliary formylglycine-generating enzyme (FGE). At the same time, it is important from a practical perspective to have the possibility of cultivating producer cell lines as suspensions free of serum or other components of animal origin. The aim of the study was to develop highly productive cell lines for the production of recombinant ASB by coexpression of the auxiliary FGE. Materials and methods: a suspension CHO cell line was used in the study. CHO cells were transfected by electroporation using the MaxCyte STX system. Monoclonal cell lines were obtained with the help of the Cell Metric system. Enzyme-linked immunosorbent assay was used for determination of ASB concentration in the culture fluid. Culture fluid samples were analysed using polyacrylamide gel electrophoresis and Western blotting. The mRNA level was measured by real-time polymerase chain reaction. Results: producer cell lines coexpressing the target ASB enzyme and auxiliary FGE were obtained. An increase in the yield of the active target ASB enzyme from 2 to 100 mg/L was achieved by selecting the optimal ratio of plasmids during transfection. The highest yield of the target ASB enzyme was achieved at the 90:10 ratio (%) of plasmids encoding the ASB and FGE genes, respectively. Conclusions: the authors developed highly productive cell lines for the production of recombinant ASB, which coexpress the target and auxiliary enzymes. The coexpression of ASB and FGE improves the growth and production characteristics of the cell line, probably due to the modification of the ASB active site. The obtained results will help resolve the problem of low enzyme yield, which is typical of this class of medicines.Мукополисахаридоз VI типа (синдром Марото–Лами) — орфанное генетическое заболевание, которое связано с дефицитом лизосомального фермента арилсульфатазы В. Актуальность исследования связана с необходимостью разработки высокопродуктивной клеточной линии-продуцента рекомбинантного фермента арилсульфатазы В. Наиболее перспективным подходом представляется создание клеточных линий-продуцентов, коэкспрессирующих целевой фермент арилсульфатазу В и вспомогательный формилглицин-генерирующий фермент на основе клеточной линии СНО. При этом большое практическое значение имеет возможность культивирования клеточных линий-продуцентов в виде суспензии, без использования сыворотки или других компонентов животного происхождения. Цель работы: разработка высокопродуктивных клеточных линий-продуцентов рекомбинантного фермента арилсульфатазы В за счет коэкспрессии вспомогательного формилглицин-генерирующего фермента. Материалы и методы: использовали суспензионную клеточную линию СНО. Трансфекцию клеток СНО проводили методом электропорации с использованием системы MaxCyte STX. Моноклональные клеточные линии получали с использованием системы Cell Metric. Концентрацию арилсульфатазы В в культуральной жидкости определяли методом иммуноферментного анализа. Образцы культуральной жидкости анализировали с применением электрофореза в полиакриламидном геле и вестерн-блота. Уровень мРНК измеряли методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. Результаты: получены клеточные линии-продуценты, коэкспрессирующие целевой фермент арилсульфатазу В и вспомогательный формилглицин-генерирующий фермент. Достигнуто увеличение выхода активного целевого фермента арилсульфатазы В с 2 до 100 мг/л за счет подбора оптимального соотношения плазмид во время трансфекции. Наибольший выход целевого фермента арилсульфатазы В наблюдался при соотношении плазмид, кодирующих гены арилсульфатазы В и формилглицин-генерирующего фермента, равном 90:10 (%). Выводы: разработаны высокопродуктивные клеточные линии-продуценты рекомбинантного фермента арилсульфатазы В, коэкспрессирующие целевой и вспомогательный ферменты. Коэкспрессия арилсульфатазы В и формилглицин-генерирующего фермента приводит к улучшению ростовых и продукционных характеристик клеточной линии, что, по-видимому, обусловлено модификацией активного центра целевого фермента арилсульфатазы В. Полученные результаты позволят решить проблему низкого выхода фермента, характерную для препаратов подобного класса

Оптимизация условий культивирования клона-продуцента, коэкспрессирующего арилсульфатазу B и формилглицин-генерирующий фермент, с целью повышения выхода фермента арилсульфатазы B

Maroteaux—Lamy syndrome (mucopolysaccharidosis type VI) is an orphan genetic disease caused by mutations in the arylsulfatase B gene (ARSB), which encodes the lysosomal enzyme arylsulfatase B (ASB). The relevance of the study lies in the need of a Russian recombinant ASB product for patients with the disease in the Russian Federation. Previously, the authors have developed producer lines coexpressing the target ASB enzyme with an auxiliary formylglycine-generating enzyme (FGE), based on Chinese hamster ovary (CHO) cells. Further development of the recombinant ASB preparation places priority on increasing the enzyme yield. The aim of this study was to increase the productivity of producer clones by optimising the culture process and adding calcium chloride and copper sulfate to the culture medium. Materials and methods: a suspension-adapted CHO cell line was used. Monoclonal cell lines were developed using Cell Metric and ClonePix FL systems. The concentration of ASB in the culture liquid was determined using the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The authors analysed batch culture and/or fed-batch culture in media supplemented with various concentrations of copper sulfate and calcium chloride. Results: the combined addition of copper sulfate and calcium chloride at concentrations of 300 μM during batch culture of producer clones coexpressing ASB and FGE increases viability and specific productivity of the cells up to 4.58±1.62 pg/ (cell×day). The cultivation of the lead producer clone coexpressing ASB and FGE under fed-batch conditions for 12 days and the addition of copper sulfate to the growth medium at the concentration of 300 μM allow for increasing the yield of the active lysosomal enzyme, arylsulfatase B, to 420 mg/L. Conclusions: the cultivation of producer clones coexpressing ASB and FGE under fed-batch conditions with copper sulfate added to the medium significantly improves cell line growth properties and the ASB yield. This approach to the selection of culture conditions for producer cell lines can be applied to other enzymes of the sulfatase family.Синдром Марото—Лами (мукополисахаридоз VI типа) — орфанное генетическое заболевание, вызванное мутациями гена ARSB, который кодирует лизосомальный фермент арилсульфатазу В. Актуальность исследования заключается в необходимости разработки отечественного препарата рекомбинантной арилсульфатазы В для лечения пациентов с данным заболеванием в Российской Федерации. Ранее были получены клеточные линии-продуценты, коэкспрессирующие целевой фермент арилсульфатазу В и вспомогательный формилглицин-генерирующий фермент на основе клеточной линии СНО. Однако для дальнейшей разработки препарата рекомбинантной арилсульфатазы В представляется важным повышение выхода фермента. Цель работы: увеличение продуктивности клонов-продуцентов за счет оптимизации процесса культивирования и добавления в культуральную среду хлорида кальция и сульфата меди. Материалы и методы: использовали суспензионную клеточную линию СНО. Моноклональные клеточные линии получали с использованием систем Cell Metric и Clone Pix FL. Концентрацию арилсульфатазы В в культуральной жидкости определяли методом иммуноферментного анализа. Использовали периодическое культивирование (batch culture) и/или периодическое культивирование с подпиткой (fedbatch culture) в среде с добавлением различных концентраций сульфата меди и хлорида кальция. Результаты: продемонстрировано, что одновременное добавление сульфата меди и хлорида кальция в концентрации 300 мкM при периодическом культивировании клонов-продуцентов, коэкспрессирующих арилсульфатазу В и формилглицин-генерирующий фермент, увеличивает жизнеспособность культур и повышает удельную продуктивность клеток до 4,58±1,62 пг/(клетка×сут). При культивировании лидерного клона-продуцента, коэкспрессирующего арилсульфатазу В и формилглицин-генерирующий фермент, в условиях периодического культивирования с подпиткой длительностью 12 сут достигнуто увеличение выхода активного лизосомального фермента арилсульфатазы В до 420 мг/л при добавлении в ростовую среду сульфата меди в концентрации 300 мкM. Выводы: культивирование клонов-продуцентов, коэкспрессирующих арилсульфатазу В и формилглицин-генерирующий фермент, в условиях периодического культивирования с подпиткой и с добавлением в среду сульфата меди приводит к значительному улучшению ростовых свойств клеточной линии и выхода целевого фермента. Данный подход в подборе условий культивирования продуцентов можно применять к другим ферментам подкласса сульфатаз

Development and Validation of a Biolayer Interferometry Method for Determination of Human Anti-PD-1 Monoclonal Antibody Concentration in Cynomolgus Serum

Some types of immunotherapy of malignant tumours are aimed at restoration of T-cells’ ability to recognize and eliminate cancer. Programmed cell death ligand-1 (PD-L1) overexpression is characteristic of many human tumours and is associated with poor prognosis for patients. The development of monoclonal antibodies (mAbs) specific for PD-L1 or PD-1 is a promising area of immunotherapy of malignant tumours. However, before a therapeutic antibody-based product enters the market, it is necessary to ensure its safety and efficacy, i.e. perform a full scope of preclinical and clinical studies. The aim of the study was to develop and validate a bioanalytical method that does not require additional labeling and that could be used for determination of mAbs specific for human PD-L1 in the blood serum of a biological test system during preclinical studies. Materials and methods: an antigen in the form of a dimer of PD-1 extra-cellular domain covalently bonded to the Fc-fragment of human IgG (R&D Systems, USA) was used in the study. The antigen was immobilised on Dip and Read™ Protein A biosensors (Fortebio, USA). The therapeutic anti-PD-1 antibody GNR-051 was developed and produced by IBC “Generium” (Russia). The healthy cynomolgus monkey serum samples used as matrix were obtained from the Research Institute of Medical Primatology (Sochi, Russia). The assessment of binding was performed using Octet® QKe interferometer (Fortebio, USA) by real-time analysis of the dose-dependent rate of the antigen-antibody complex formation. Results: the paper presents experimental data on the development and validation of the test method for determination of the therapeutic PD-1-binding mAb concentration in cynomolgus monkey serum in the antibody concentration range from 2 to 2500 µg/mL. The authors assessed the calibration curve reliability, between-run and within-run precision and accuracy, dilution linearity, specificity and selectivity of the test method. Conclusions: the authors developed and validated the biolayer interferometry-based method for determination of therapeutic mAbs concentration. The method was shown to comply with the Eurasian Economic Union’s regulatory requirements in terms of the main validation parameters: analytical range, accuracy, precision, and selectivity

Physico-Chemical and Biological Properties of Biosimilar and Reference Tissue Plasminogen Activator Products

Recombinant tissue plasminogen activator (international nonproprietary name — alteplase) which was developed by «GENERIUM» (Russia) and received a marketing authorisation in Russia is completely analogous to Actilyse® which is used to treat medical conditions accompanied by thrombosis, such as acute myocardial infarction, pulmonary embolism, and ischemic stroke. The aim of the study was to carry out a comprehensive comparison of physico-chemical and biological properties of Revelyse® and the reference product Actilyse® in order to assess their biosimilarity. Materials and Methods: comparative peptide mapping and determination of comparability of chromatographic profiles of tryptic hydrolysates was performed using RP-HPLC and massspectrometry; the molecular weight distribution was determined by mass-spectrometry and polyacrylamide gel electrophoresis (Laemmli method). The purity and homogeneity of products as well as the content of related impurities (oligomers and fragments) were determined using gel filtration; N-glycosylation profile was analysed by hydrophilic HPLC, total sialic acid was quantified by the Svennerholm resorcinol method. Protein binding to fibrin and human fibrinogen was assessed by surface plasmon resonance, and the specific activity was compared by fibrin clot lysis. Results: the research demonstrated a complete overlap of the products’ peptide maps, which indicates the identity of аlteplase amino acid sequences in the two medicines being compared. The authors of the study also determined the molecular weight and the content of the intact single-stranded form of the protein, and quantified post-translational modifications, the content of sialic acids and neutral sugars. The analysis of the N-glycosylation profile revealed insignificant differences in the percentage of multiantenna complex glycans. The specificity of alteplase was evaluated by analysing the formation of protein complexes with natural alteplase ligands – fibrin and plasminogen activator inhibitor-1, but no significant differences were found. The comparison of specific activation of plasminogen fibrinolytic activity was performed based on the results of the assay analysing the fibrin clot lysis rate, and it demonstrated comparability of Revelyse® and Actilyse®. Conclusions: comparative experimental studies have shown no differences in the structure, charge distribution heterogeneity, impurities content, and specific activity of alteplase as a component of Revelyse® and the reference product Actilyse®, which leads to the conclusion that they are similar in terms of physicochemical and biological properties

Internalization of Recombinant Imiglucerase into Mouse Peritoneal Macrophages and L929 Mouse Fibroblasts

Enzyme replacement therapy (ERT) is one of the most efficient treatments for lysosomal storage diseases. Type 1 Gaucher disease is caused by β-glucocerebrosidase enzyme deficiency, which may be compensated for by intravenous infusions of imiglucerase—a recombinant enzyme. Imiglucerase targets macrophages and enters these cells via interaction with mannose receptors on the cell membrane. Characterisation of internalization of enzymes by target cells is important in the context of the development of new medicines and production of existing ERT medicines. The peritoneal and alveolar macrophages, as well as macrophages of the spleen of small laboratory animals (rats and mice) are widely used in such studies. However, isolation of cells from animal sources raises ethical issues, and therefore continuous mammalian cell lines may offer an attractive alternative. The aim of the study: to conduct comparative studies on the internalization of recombinant imiglucerase into mouse peritoneal macrophages and L929 mouse fibroblasts. Materials and methods: CerezymeR batches 7HV0913, C6214H05, 7HV0888 (Genzyme Ltd., UK); Glurazim batches 020416, 011117, 021117 (LLC “IBC “Generium”, Russia). We used peritoneal macrophages obtained from BALB/c mice and L929 mouse fibroblasts. The cells were cultured in DMEM/F12 complete growth medium with 10% fetal bovine serum. The activity of imiglucerase internalized into the cells was evaluated spectrophotometrically by hydrolysis of the artificial substrate—4-methylumbelliferyl-β-Dglucopyranoside. Results: the study compared internalization of recombinant imiglucerase (the active ingredient of CerezymeR and Glurazim) by mouse peritoneal macrophages and L929 mouse fibroblasts. It was demonstrated that the medicines activity in the lysates of peritoneal macrophages is comparable with that in the lysates of L929 mouse fibroblasts. Regardless of the model system, the activity of Glurazim stayed within the acceptable range (80–125%) established for biosimilar products. Conclusions: the experiments proved that L929 mouse fibroblasts could be recommended for assessment of internalization of recombinant imiglucerase

Разработка и валидация методики определения концентрации антитела человека, блокирующего связывание PD-1 с лигандами, в сыворотке крови яванского макака методом биослойной интерферометрии

Some types of immunotherapy of malignant tumours are aimed at restoration of T-cells’ ability to recognize and eliminate cancer. Programmed cell death ligand-1 (PD-L1) overexpression is characteristic of many human tumours and is associated with poor prognosis for patients. The development of monoclonal antibodies (mAbs) specific for PD-L1 or PD-1 is a promising area of immunotherapy of malignant tumours. However, before a therapeutic antibody-based product enters the market, it is necessary to ensure its safety and efficacy, i.e. perform a full scope of preclinical and clinical studies. The aim of the study was to develop and validate a bioanalytical method that does not require additional labeling and that could be used for determination of mAbs specific for human PD-L1 in the blood serum of a biological test system during preclinical studies. Materials and methods: an antigen in the form of a dimer of PD-1 extra-cellular domain covalently bonded to the Fc-fragment of human IgG (R&D Systems, USA) was used in the study. The antigen was immobilised on Dip and Read™ Protein A biosensors (Fortebio, USA). The therapeutic anti-PD-1 antibody GNR-051 was developed and produced by IBC “Generium” (Russia). The healthy cynomolgus monkey serum samples used as matrix were obtained from the Research Institute of Medical Primatology (Sochi, Russia). The assessment of binding was performed using Octet® QKe interferometer (Fortebio, USA) by real-time analysis of the dose-dependent rate of the antigen-antibody complex formation. Results: the paper presents experimental data on the development and validation of the test method for determination of the therapeutic PD-1-binding mAb concentration in cynomolgus monkey serum in the antibody concentration range from 2 to 2500 µg/mL. The authors assessed the calibration curve reliability, between-run and within-run precision and accuracy, dilution linearity, specificity and selectivity of the test method. Conclusions: the authors developed and validated the biolayer interferometry-based method for determination of therapeutic mAbs concentration. The method was shown to comply with the Eurasian Economic Union’s regulatory requirements in terms of the main validation parameters: analytical range, accuracy, precision, and selectivity. Целью некоторых видов иммунотерапии злокачественных опухолей является восстановление способности Т-клеток распознавать и уничтожать опухолевые клетки. Сверхэкспрессия лиганда запрограммированной клеточной смерти (PD-L1) распространена во многих опухолях человека и связана с плохим прогнозом для пациента. Разработка моноклональных антител, специфичных к PD-L1 или PD-1, является перспективным направлением в иммунотерапии злокачественных новообразований. Однако прежде чем лекарственный препарат на основе терапевтического антитела появится на фармацевтическом рынке, необходимо убедиться в его безопасности и эффективности, то есть провести доклинические и клинические исследования в полном объеме. Цель работы: разработать и валидировать биоаналитическую методику, позволяющую без внесения дополнительных меток определить концентрацию моноклонального антитела, специфичного к PD-1 человека, в сыворотке крови биологической тест-системы в ходе проведения доклинических исследований. Материалы и методы: в работе использовали антиген в виде димера внеклеточного домена рецептора PD-1, ковалентно связанного с Fc-фрагментом иммуноглобулина человека (R&D Systems, США). Антиген иммобилизовали на биосенсоры Dip and Read™ Protein A (Fortebio, США). Терапевтическое моноклональное анти-PD-1 антитело GNR-051 произведено в ООО «МБЦ «Генериум» (Россия). Используемые в качестве матрицы образцы сыворотки крови здоровых яванских макак получены в ФГБНУ «НИИ МП» (г. Сочи, Россия). Оценку связывания проводили с помощью интерферометра Octet® QKe (Fortebio, США) в режиме наблюдения в реальном времени дозозависимой скорости формирования комплекса антиген–антитело. Результаты: представлены экспериментальные данные по разработке и валидации методики определения концентрации препарата моноклонального терапевтического антитела, связывающегося с клеточным рецептором PD-1, в сыворотке крови яванского макака в диапазоне концентраций антитела 2–2500 мкг/мл. Проведена оценка устойчивости параметров градуировочной кривой, оценка правильности и прецизионности между опытами и внутри опыта, оценка линейности разведения, исследована специфичность и селективность методики. Выводы: разработана и валидирована методика определения концентрации препарата моноклонального терапевтического антитела на основе биослойной интерферометрии. Показано соответствие методики требованиям нормативных документов ЕврАзЭС по основным валидационным характеристикам – аналитическому диапазону, правильности, прецизионности и селективности