Deciphering the stem cell machinery as a basis for understanding the molecular mechanism underlying reprogramming

Stem cells provide fascinating prospects for biomedical applications by combining the ability to renew themselves and to differentiate into specialized cell types. Since the first isolation of embryonic stem (ES) cells about 30 years ago, there has been a series of groundbreaking discoveries that have the potential to revolutionize modern life science. For a long time, embryos or germ cell-derived cells were thought to be the only source of pluripotency—a dogma that has been challenged during the last decade. Several findings revealed that cell differentiation from (stem) cells to mature cells is not in fact an irreversible process. The molecular mechanism underlying cellular reprogramming is poorly understood thus far. Identifying how pluripotency maintenance takes place in ES cells can help us to understand how pluripotency induction is regulated. Here, we review recent advances in the field of stem cell regulation focusing on key transcription factors and their functional interplay with non-coding RNAs

Sox2 Is Essential for Formation of Trophectoderm in the Preimplantation Embryo

In preimplantation mammalian development the transcription factor Sox2 (SRY-related HMG-box gene 2) forms a complex with Oct4 and functions in maintenance of self-renewal of the pluripotent inner cell mass (ICM). Previously it was shown that Sox2-/- embryos die soon after implantation. However, maternal Sox2 transcripts may mask an earlier phenotype. We investigated whether Sox2 is involved in controlling cell fate decisions at an earlier stage.We addressed the question of an earlier role for Sox2 using RNAi, which removes both maternal and embryonic Sox2 mRNA present during the preimplantation period. By depleting both maternal and embryonic Sox2 mRNA at the 2-cell stage and monitoring embryo development in vitro we show that, in the absence of Sox2, embryos arrest at the morula stage and fail to form trophectoderm (TE) or cavitate. Following knock-down of Sox2 via three different short interfering RNA (siRNA) constructs in 2-cell stage mouse embryos, we have shown that the majority of embryos (76%) arrest at the morula stage or slightly earlier and only 18.7-21% form blastocysts compared to 76.2-83% in control groups. In Sox2 siRNA-treated embryos expression of pluripotency associated markers Oct4 and Nanog remained unaffected, whereas TE associated markers Tead4, Yap, Cdx2, Eomes, Fgfr2, as well as Fgf4, were downregulated in the absence of Sox2. Apoptosis was also increased in Sox2 knock-down embryos. Rescue experiments using cell-permeant Sox2 protein resulted in increased blastocyst formation from 18.7% to 62.6% and restoration of Sox2, Oct4, Cdx2 and Yap protein levels in the rescued Sox2-siRNA blastocysts.We conclude that the first essential function of Sox2 in the preimplantation mouse embryo is to facilitate establishment of the trophectoderm lineage. Our findings provide a novel insight into the first differentiation event within the preimplantation embryo, namely the segregation of the ICM and TE lineages

Kinetische Untersuchungen an pulsradiolytisch erzeugten CH,CH3,C2CH, CH_{3},C_{2} und CN2CN_{2} Radikalen mittels Absorptionsspektroskopie in der Gasphase

6.1. $\underline{Methan}$ : Es wurde gefunden, daß bei der radiolytischen Zersetzung des Methans die Radikale $CH_{3}$, CH und $C_{2}$ auftreten. Neben dem in dieser Arbeit nicht direkt nachgewiesenen $CH_{2}$-Radikal und den Ionen spielen das $CH_{3}$, und CH die größte Rolle. Das $C_{2}$ hingegen scheint von untergeordneter Bedeutung zu sein und konnte nur bei kleinen Methandrücken ( ~ 1 Torr) nachgewiesen werden. Das $C_{2}$ reagiert mit Methan (k = 4.6 x $10^{9}$ l/mol.s) und dürfte Azetylen bilden. Die Hauptreaktion in reinem Methan ist die Rückbildung des Methans durch Reaktion (1), die bis etwa 100 Torr nach der$CH_{3}$ + H $\xrightarrow M$ $CH_{4}$ (1) dritten Ordnung mit k = (8.3 $\pm$ 0.2) x $10^{13} 1^{2}mol^{-2}s^{-1}$ und oberhalb 500 Torr druckunabhängig mit $3.3 x 10^{11}$ l/mol.s verläuft. Die Geschwindigkeitskonstanten für die Reaktionen des CH-Radikals mit $CH_{4}, C_{3}H_{8}, n-C_{4}H_{10}, C_{2}H_{4} und C_{2}H_{2}$ zeigen Stoßausbeuten von 0.1 bis 0.3. Für die Reaktion des CH mit Methan, wobei Äthylen und Azetylen wahrscheinlich gebildet werden, wurde eine Geschwindigkeitskonstantevon 2 x $10^{10}$ l/mol.s gemessen. Dieser Befund steht im Gegensatz zu dem bisher bekannten Wert. Der Gegensatz könnte darauf beruhen, daß die Verteilung der Rotationsenergie des CH-Radikals unterschiedlich war. Messungen der Reaktionsgeschwindigkeitenin Abhängigkeit von der Rotationsquantenzahl wären daher von großer Wichtigkeit. Weder das CH-Radikal noch der größte Teil des $CH_{3}$, sind primäre Produkte. Die Abhängigkeit der $CH_{3}$,-Ausbeute vom Methandruck deutet auf eine komplexe Reaktionsfolge hin. Wahrscheinlich wird das $CH_{3}$, einmal durch Abstraktion heißer H-Atome und zum anderen durch Einschub von Singulett-Methylen in Methan nebst anschließendem Zerfall des angeregten Äthans gebildet. In 100 Torr Methan wurde $G(CH_{3}$) = 7.3 und die Ausbeute an Äthan, die auf eine Rekombination der Methylradikale zurückzuführen ist zu G $\thicksim$ 1 bestimmt. Daraus ergibt sich, daß etwa 70 % der $CH_{3}$-Radikale nach Reaktion (1) verschwinden. Der G-Wert des CH-Radikals wurde zu 0.5 abgeschätzt und ein Extinktionskoeffizient des Übergangs CH (C - X) von $6 x 10^{4} M^{-1}cm^{-1}$ erhalten.6.2. $\underline{CNN}$: Das CNN-Radikal bildet sich bei der Bestrahlung von $CO/N_{2}$-Gemischen mit Elektronen wahrscheinlich durch die Reaktion von C-Atomen mit Stickstoff (k = 1.4 x $10^{7}$ 1/mol.s). Die Lebensdauer des CNN-Radikals in solchen Gemischen ist relativ groß (150 $\mu$sec), so daß Reaktionsraten dieses Radikals mit verschiedenen Substanzen gemessen werden konnten. Es wurden keine Informationen über die Reaktionsprodukte und die Ausbeute des CNN erhalten. Aus einem Vergleich der Geschwindigkeitskonstanten ergibt sich, daß das CNN-Radikal mit diesen Substanzen langsamer als das CN-Radikal reagiert aber rascher als das Triplett-$CH_{2}$-Radikal