Disección molecular de la interacción de TBP con las homeoproteínas Scr, Ubx y AbdB mediante BiFC en la línea celular HEK293

Las homeoproteínas son factores transcripcionales que regulan la expresión de genes que definen la identidad de los segmentos en los organismos. Estos factores transcripcionales presentan una amplia multiplicidad de interacciones con otras moléculas como cofactores que aumentan su especificidad de unión al DNA y proteínas involucradas en la regulación de la expresión génica, entre las que se incluyen las de la maquinaria basal de transcripción como lo son BIP2, Med19, TFIIEβ, M1BP y TBP. En nuestro laboratorio se ha determinado que TBP interacciona con Antennapedia (Antp) y Abdominal A (AbdA) a través de la región rica en glutaminas de Antp y el HD de AbdA. Adicionalmente, existe evidencia de que los homopéptidos de glutaminas de TBP tienen una función transactivadora y son un dominio de interacción con TFs como TFIIB y Antp. Debido a la importancia de la interacción entre homeoproteínas y la maquinaria basal de transcripción en la regulación de la expresión génica y a la poca evidencia que existe, el propósito de esta tesis fue elucidar si TBP interacciona con Sex combs reduced (Scr), Ultrabithorax (Ubx) y Abdominal-B (AbdB), así como determinar los dominios funcionales involucrados. Para determinar las interacciones proteicas mediante Complementación Bimolecular Fluorescente en la línea celular HEK293 se cotransfectó el vector que codifica el extremo N-terminal de la proteína fluorescente Venus fusionado con TBP (o TBPΔQ) con los vectores que codifican al extremo C-terminal de Venus fusionado a las homeoproteínas Scr, Ubx y AbdB o sus homeodominios. En todos los casos la interacción se determinó mediante el análisis de la reconstitución de la fluorescencia de Venus con respecto a la fluorescencia de mCherry, utilizado como control. Los resultados obtenidos indican que TBP interacciona con Scr, Ubx y AbdB dando 72.39%, 70% y 94.91%, respectivamente, muy similar a la interacción con Antp. Estas interacciones son afectadas significativamente en ausencia del homopéptido de glutaminas de TBP disminuyendo a 24.57%, 34.16% y 49.22%, respectivamente. Además, al probar la interacción con los homeodominios se encontró que la interacción de estas homeoproteínas con TBP se reduce de forma significativa, dando 44.12%, 41% y 60.55%, respectivamente, indicando que otras regiones están involucradas en estas interacciones. Estos resultados indican que hay cierta similitud en los mecanismos interacción y por lo tanto en la regulación génica durante el desarrollo en Drosophila

TATA-box Binding Protein interacts with Antp, Scr, Ubx and AbdB through their N-terminal domains

Background: Hox proteins are transcriptional factors (TFs) that define segment identity during embryonic development regulating specific target genes. These TFs interact with cofactors for DNA specificity and other TFs to regulate gene expression, which include basal transcriptional machinery members like BIP2, Med19, TFIIEβ, M1BP and TBP. Since TBP glutamine homopeptide (PolyQ) act as an interaction domain involved transcriptional regulation, we analyzed if TBP interact with Antp, Scr, Ubx and AbdB through its PolyQ region. Methods: We used Bimolecular Fluorescent Complementation (BiFC) to determine TBP interaction with Antp, Scr, Ubx and AbdB as well as the implication of their homeodomain (HD) and the TBP polyQ region. We used expression vectors carrying the sequences of TBP and its PolyQ lacking version (TBP∆Q) fused to the N-terminal half of Venus (VN) and Antp, Scr, Ubx and AbdB as well as their HDs fused to the C-terminal (VC). All VN and VC constructions were co-transfected with pCAGmCherry in HEK293 cells. Fluorescent cells were quantified and BiFC percentage was calculated as green cells per each 100 red cells. We also used UAS-GAL4 system to direct the expression of VNTBP and VCAntp or AntpHD in D. melanogaster embryos using a Ptc-GAL4 driver. BiFC fluorescent embryos were acquired by confocal microscopy. Results: The results showed that TBP interact with Antp (78%), Scr (72%), Ubx (70%) and AbdB (95%) in cell culture. The interaction with HD decreased interaction percentage as follows: AntpHD(50%), ScrHD(44%), UbxHD(41%) and AbdBHD(61%) indicating the implication of the N-terminal in these interactions. Also, the PolyQ deletion in TBP decreased the signal to 41%, 25%, 34% and 49%, respectively, confirming the PolyQ importance in these interactions. The combination of deletions both in TBP and homeoproteins showed an additive effect. Additionally, we corroborated the TBP-Antp interaction in D. melanogaster embryos by BiFC and the Antp N-terminal involvement in this interaction as well. Conclusions: TBP interaction with Antp, Scr, Ubx and AbdB is mediated by Hox N-terminal regions and the PolyQ domain of TBP as well. Furthermore, TBP-Antp interaction also occurs in vivo, suggesting that they could have similar transcriptional regulation during development of Drosophila melanogaster

Mientras más, mejor: Análisis de interacciones proteicas mediante fluorescencia

El estudio de las interacciones entre proteínas es de gran relevancia para entender los mecanismos moleculares dentro de las células. En las últimas décadas, se han desarrollado estrategias que permiten el análisis de interacciones proteicas sin alterar la estructura celular e incluso se ha logrado combinar estas técnicas para identificar la formación de complejos multiproteicos. El objetivo de esta revisión es mostrar un panorama general en el estudio de las interacciones proteína-proteína, haciendo énfasis en estrategias fluorescentes tanto de complementación como de transferencia de energía y su combinación para el análisis de las interacciones proteicas. Se concluye que las estrategias de marcaje fluorescente como BiFC, BiLC, FRET y BRET han desplazado las técnicas clásicas con enfoques más novedosos.El estudio de las interacciones entre proteínas es de gran relevancia para entender los mecanismos moleculares dentro de las células. En las últimas décadas, se han desarrollado estrategias que permiten el análisis de interacciones proteicas sin alterar la estructura celular e incluso se ha logrado combinar estas técnicas para identificar la formación de complejos multiproteicos. El objetivo de esta revisión es mostrar un panorama general en el estudio de las interacciones proteína-proteína, haciendo énfasis en estrategias fluorescentes tanto de complementación como de transferencia de energía y su combinación para el análisis de las interacciones proteicas. Se concluye que las estrategias de marcaje fluorescente como BiFC, BiLC, FRET y BRET han desplazado las técnicas clásicas con enfoques más novedosos

Drosophila en el estudio de las interacciones proteicas de hTBP en el desarrollo y modelaje de SCA17

Antecedentes: Las interacciones proteicas participan en una gran cantidad de mecanismos moleculares que rigen los procesos celulares. La proteína de unión a la caja TATA humana (hTBP) interacciona con Antennapedia (Antp) a través de su extremo N-terminal, específicamente a través de sus homopéptidos de glutaminas. Esta región PolyQ sirve como sitio de unión a factores de transcripción en condiciones normales, pero cuando se expande genera la ataxia espinal cerebelosa 17 (SCA17), cuyos agregados proteicos en el cerebro impiden su funcionamiento correcto. Objetivo: Determinar si la región rica en glutaminas de hTBP interviene en su interacción con homeoproteínas y el papel que tiene en la formación de agregados proteicos en SCA17. Material y métodos: Se caracterizó la interacción de hTBP con otras homeoproteínas usando BiFC y se modeló SCA17 en Drosophila melanogaster dirigiendo hTBPQ80 al cerebro de las moscas usando UAS/GAL4. Resultados: Existió interacción de hTBP con homeoproteínas a través de su región rica en glutaminas. Los agregados proteicos de hTBP con las glutaminas expandidas afectaron la capacidad locomotriz de las moscas. Conclusiones: El estudio de las interacciones de hTBP abre la posibilidad para la búsqueda de nuevas estrategias terapéuticas en patologías neurodegenerativas como SCA17

Drosophila en el estudio de las interacciones proteicas de hTBP en el desarrollo y modelaje de SCA17

Antecedentes: Las interacciones proteicas participan en una gran cantidad de mecanismos moleculares que rigen los procesos celulares. La proteína de unión a la caja TATA humana (hTBP) interacciona con Antennapedia (Antp) a través de su extremo N-terminal, específicamente a través de sus homopéptidos de glutaminas. Esta región PolyQ sirve como sitio de unión a factores de transcripción en condiciones normales, pero cuando se expande genera la ataxia espinal cerebelosa 17 (SCA17), cuyos agregados proteicos en el cerebro impiden su funcionamiento correcto. Objetivo: Determinar si la región rica en glutaminas de hTBP interviene en su interacción con homeoproteínas y el papel que tiene en la formación de agregados proteicos en SCA17. Material y métodos: Se caracterizó la interacción de hTBP con otras homeoproteínas usando BiFC y se modeló SCA17 en Drosophila melanogaster dirigiendo hTBPQ80 al cerebro de las moscas usando UAS/GAL4. Resultados: Existió interacción de hTBP con homeoproteínas a través de su región rica en glutaminas. Los agregados proteicos de hTBP con las glutaminas expandidas afectaron la capacidad locomotriz de las moscas. Conclusiones: El estudio de las interacciones de hTBP abre la posibilidad para la búsqueda de nuevas estrategias terapéuticas en patologías neurodegenerativas como SCA1