Investigação da Atividade e Mecanismos de Ação Leishmanicida e/ou Tripanocida de Produtos Naturais e um Derivado

Submitted by Nuzia Santos ([email protected]) on 2015-11-20T16:44:55Z No. of bitstreams: 1 Tunes.pdf: 27891545 bytes, checksum: 4feb76814de1de7da1d4a476de6f2134 (MD5)Approved for entry into archive by Nuzia Santos ([email protected]) on 2015-11-20T16:45:17Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tunes.pdf: 27891545 bytes, checksum: 4feb76814de1de7da1d4a476de6f2134 (MD5)Made available in DSpace on 2015-11-20T16:45:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tunes.pdf: 27891545 bytes, checksum: 4feb76814de1de7da1d4a476de6f2134 (MD5) Previous issue date: 2015Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas René Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil.No Brasil, a doença de Chagas e as leishmanioses têm importante impacto na saúde pública. Os fármacos usados no tratamento dessas enfermidades apresentam limitações que tornam necessária a busca por novas alternativas terapêuticas. Nesse sentido, no presente estudo foram selecionados sete produtos naturais bioativos (PNB) e um derivado de produto natural (dPNB) e suas atividades tripanocida e leishmanicida foram determinadas e/ou confirmadas. A eleuterine, a tiofenonaftoquinona (TNQ) e a aurentiacina foram descritas como leishmanicidas pela primeira vez, sendo suas atividades antiamastigota de 99, 99 e 98 %, respectivamente. O lapachol, a chalcona 1 e a chalcona 2 tiveram o efeito leishmanicida confirmado com atividade de 85, 99 e 99 %, respectivavente. Nenhuma substância foi considerada ativa no modelo de T. cruzi utilizado. Devido às quantidades de substâncias disponíveis, apenas o lapachol e a TNQ tiveram seus mecanismos de ação leishmanicida estudados. As concentrações inibitórias de 50% (CI50) da TNQ foram inferiores àquelas do lapachol em promastigotas (2 e 25 μM), amastigotas recuperadas de lesão (22 e 224 μM) e amastigotas intracelulares (7,4 e 84 μM). A razão entre a CI50 em amastigotas intracelulares e macrófagos foi utilizada para o cálculo do índice de seletividade, sendo este 3,8 para o lapachol e 7,7 para a TNQ. Os PNB e dPNB leishmanicida foram avaliados quanto à atividade inibitória da enzima tripanotiona redutase (TR), sendo que nenhum foi capaz de inibir a enzima. Os efeitos induzidos por TNQ e lapachol sobre a atividade mitocondrial de promastigotas foram avaliados por citometria de fluxo e respirometria. O tratamento com lapachol induziu perda do potencial de membrana mitocondrial e reduziu o consumo de oxigênio pelos parasitos. Por sua vez, a TNQ não alterou esses parâmetros. Análises de microscopia eletrônica de transmissão mostraram que o tratamento com lapachol ou TNQ induziu danos no complexo de Golgi e na bolsa flagelar, formação de vesículas e perfil de autofagia. O lapachol, mas não a TNQ, também induziu alterações ultraestruturais nas mitocôndrias das promastigotas. Em conjunto, os resultados permitem propor que a mitocôndria seja um importante alvo celular para o lapachol. Uma vez que a TNQ não causou alterações na mitocôndria dos parasitos, mas induziu danos em outras organelas, pode-se propor que seu mecanismo de ação esteja relacionado à indução de estresse oxidativo. Este trabalho reforça a importância dos PNB na descoberta de novas substâncias bioativas, as quais podem ser objeto de estudos de mecanismos de ação, a fim de se expandir o conhecimento disponível para o processo de desenvolvimento de novos fármacos usados para o tratamento de endemias que afligem milhões de pessoas como as leishmanioses e a doença de Chagas.In Brazil, Chagas disease and leishmaniasis cause great impact on public health. The drugs currently used to treat these diseases have limitations that make necessary the search for new therapeutic alternatives. In this context, seven bioactive natural products (BNP) and one derivative (BNPd) were selected for investigations. Their trypanocidal and leishmanicidal activities were detected or confirmed. Eleutherine, naphthothiophenquinone (TNQ) and aurentiacin had their leishmanicidal activity described for the first time in this study, reducing almost 100% of the parasites growth. Lapachol, chalcone 1 and chalcone 2 had their leishmanicidal activity confirmed. None were active on T. cruzi intracellular amastigote and trypomastigote model. Because of the available amounts of compounds, only lapachol and TNQ had their leishmanicidal mechanism of action studied. The inhibitory concentrations of 50% of the parasite growth (IC50) induced by TNQ were inferior of that of lapachol in promastigotes (2 μM and 25 μM), lesion derived amastigotes (22 μM and 224 μM) and intracellular amastigotes (7.4 μM and 84 μM). The ratio between the IC50 on macrophages and intracellular amastigotes was used to calculate the selectivity index, lapachol’s was 3.8 and TNQ’s was 7.7. The leishmanicidal BNP and BNPd were evaluated as to their ability to inhibit trypanothione reductase (TR) and none of the compounds were able to inhibit the enzyme. The effects induced by the compounds on promastigotes mitochondrial activity were assessed using flow citometry and respirometry. Treatment using lapachol induced loss of mitochondrial membrane potential and reduced oxygen consumption by the parasites. On the other hand, TNQ did not alter those parameters. Transmission electron microscopy showed that lapachol and TNQ induced damage to the Golgi complex, flagellar pocket, formation of vesicles and autophagy profile. Lapachol, but not TNQ, induced ultrastrucutral alterations on promastigotes mitochondria. These results suggest that mitochondria are an important target for lapachol. As TNQ did not alter the parasites mitochondrial function or structure, but induced important ultrastructural alterations in other organelles, we can assume that its mechanism of action could be related to induction of oxidative stress. The present work reinforces the importance of BNP in the discovery of new active compounds that can be used for mechanism of action studies, contributing to the knowledge required for drug development to treat diseases that afflict millions of people worldwide such as leishmaniasis and Chagas disease

Leishmanicidal compounds of Nectria pseudotrichia, an endophytic fungus isolated from the plant Caesalpinia echinata (Brazilwood)

Submitted by Nuzia Santos ([email protected]) on 2018-03-07T17:32:29Z No. of bitstreams: 1 Leishmanicidal compounds of Nectria pseudotrichia.pdf: 404788 bytes, checksum: d3f619503129576e6ba497bfcd75b025 (MD5)Approved for entry into archive by Nuzia Santos ([email protected]) on 2018-03-07T17:38:29Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Leishmanicidal compounds of Nectria pseudotrichia.pdf: 404788 bytes, checksum: d3f619503129576e6ba497bfcd75b025 (MD5)Made available in DSpace on 2018-03-07T17:38:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Leishmanicidal compounds of Nectria pseudotrichia.pdf: 404788 bytes, checksum: d3f619503129576e6ba497bfcd75b025 (MD5) Previous issue date: 2018Fundação Oswaldo Cruz. Instituto René Rachou. Laboratório de Química de Produtos Naturais Bioativos. Belo Horizonte, MG, BrasilFundação Oswaldo Cruz. Instituto René Rachou. Laboratório de Genômica Funcional e Proteômica de Leishmania spp. e Trypanosoma cruzi. Belo Horizonte, MG, BrasilFundação Oswaldo Cruz. Instituto René Rachou. Laboratório de Química de Produtos Naturais Bioativos. Belo Horizonte, MG, BrasilUniversidade Federal de Minas Gerais. Departamento de Fisiologia e Biofísica. Belo Horizonte, MG, BrasilUniversidade Estadual do Sudoeste da Bahia. Departamento de Química. Jequié, BA, BrasilFundação Oswaldo Cruz. Instituto René Rachou. Laboratório de Química de Produtos Naturais Bioativos. Belo Horizonte, MG, BrasilFundação Oswaldo Cruz. Instituto René Rachou. Laboratório de Química de Produtos Naturais Bioativos. Belo Horizonte, MG, BrasilUniversidade Federal de Minas Gerais. Departamento de Fisiologia e Biofísica. Belo Horizonte, MG, BrasilUniversidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri. Departamento de Ciências Biológicas e da Saúde. Diamantina, MG, BrasilFundação Oswaldo Cruz. Instituto René Rachou. Laboratório de Química de Produtos Naturais Bioativos. Belo Horizonte, MG, BrasilBACKGROUND: In a screen of extracts from plants and fungi to detect antileishmanial activity, we found that the ethyl acetate extract of the fungus Nectria pseudotrichia, isolated from the tree Caesalpinia echinata (Brazilwood), is a promising source of bioactive compounds. OBJECTIVES: The aims of this study were to isolate and determine the chemical structures of the compounds responsible for the antileishmanial activity of the organic extract from N. pseudotrichia. METHODS: Compounds were isolated by chromatographic fractionation using semi-preparative high-performance liquid chromatography, and their chemical structures were determined by analytical and spectral data and by comparison with published data. The antileishmanial activity of the isolated compounds was evaluated in intracellular amastigote forms of Leishmania (Viannia) braziliensis expressing firefly luciferase as reporter gene, and cytotoxicity was determined in Vero and THP-1 mammalian cell lines by MTT assay. FINDINGS: Fractionation of the extract yielded seven compounds: 10-acetyl trichoderonic acid A (1), 6′-acetoxy-piliformic acid (2), 5′,6′-dehydropiliformic acid (3), piliformic acid (4), hydroheptelidic acid (5), xylaric acid D (6), and cytochalasin D (7). Compounds 1, 2 and 3 are reported here for the first time. Compounds 1, 2, and 5 were more active, with IC50 values of 21.4, 28.3, and 24.8 µM, respectively, and showed low toxicity to Vero and THP-1 cells. MAIN CONCLUSIONS: N. pseudotrichia produces secondary metabolites that are more toxic to intracellular amastigote forms of L. (V.) braziliensis than to mammalian cells