Identifizierung und Charakterisierung der ursächlichen genetischen Defekte für autosomal rezessive mentale Retardierung in zwei iranischen Familien

Intellectual disability (ID) is the hallmark of an extremely heterogeneous group of disorders that comprises a wide variety of syndromic and non- syndromic phenotypes. I report here on two consanguineous Iranian families with members that are affected by autosomal recessive ID. The affected individuals of family M289 present with moderate ID and borderline microcephaly without any other co-morbidities. The only sequence alteration I identified in this family is a mutation (c.514G > A [p.D172N]) in the SARS gene, which encodes the cytoplasmic seryl-tRNA synthetase SARS that is responsible for charging tRNA-Ser and tRNA-Sec with serine (aminoacylation). In silico modeling of SARS revealed that p.D172 is located in proximity to the active site and provides a negative charge, which is lost upon mutation. To understand whether the aminoacylation reaction is affected, the capability of serine activation of SARS wild-type (WT) and mutant proteins was studied in a pyrophosphate (PPi) release assay. Moreover, concordant with in silico predictions, expression studies comparing WT and mutant SARS in mammalian cells provided evidence that SARS p.D172N is unstable. In family M8600485 affected individuals presented with a profound syndromic phenotype including ID, hypotonia and tonic-clonic seizures. In the already available genome wide linkage data from this family, I found ALDH5A1 to be present within the sole linkage interval with significant LOD-Score on chromosome six. As the patient phenotype was strongly overlapping with the features commonly observed in individuals affected with congenital succinic semialdehyde dehydrogenase (SSADH) deficiency, which is caused by mutations in ALDH5A1, I sequenced this gene in the index patient of M8600485. This revealed a novel missense mutation c.901A > G [p.K301E] within ALDH5A1 cosegregating with the SSADH deficiency phenotype. In silico protein modeling showed that p.K301E leads to a putative loss of NAD+ binding. Concordant with this prediction, no SSADH enzyme activity could be detected in patient lymphoblasts at various NAD+ concentrations. The mutation p.K301E is located near the active site and is only the second mutation identified to date that might affect SSADH activity through an impairment of NAD+ binding.Besonders autosomal-rezessive mentale Retardierung ist durch ausgeprägte Heterogenität gekennzeichnet und umfasst eine große Vielfalt von syndromalen und nicht-syndromalen Formen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei iranische, konsanguine Familien mit mental retardierten Mitgliedern untersucht. Die Patienten der Familie M289 weisen eine mittelschwere Form mentaler Retardierung auf und haben neben grenzwertiger Mikrozephalie keine weiteren Begleitsymptome. Als einzige Mutation mit krankheitsauslösendem Potential wurde die c.514G > A [p.D172N] Sequenzvariante in SARS identifiziert. SARS kodiert die cytoplasmatische Seryl-tRNA-Synthetase, deren Funktion die Beladung von tRNA-Ser und tRNA-Sec mit Serin ist (tRNA-Aminoacylierung). Anhand von in silico-Protein-Modellierung wurde gezeigt, dass p.D172 in der Nähe des aktiven Zentrums von SARS liegt und mit einer negativen Ladung wahrscheinlich zur Aufrechterhaltung einer hydrophoben Umgebung beiträgt. Diese Ladung geht durch die p.D172N-Substitution verloren. Um herauszufinden, ob die p.D172N-Mutation die enzymatische Funktion von SARS beeinträchtigt, wurde die Freisetzung von Pyrophosphat (PPi) während des ersten Reaktionsschritts der tRNA-Aminoacylierung untersucht. Weiterhin wurde mittels Western Blot und Zellfraktionierung gezeigt, dass SARS p.D172N in menschlichen Zellen wahrscheinlich instabil ist. Die Patienten der Familie M8600485 haben ein syndromales Krankheitsbild mit schwerer mentaler Retardierung, Entwicklungsverzögerung, verzögerter Sprachentwicklung und generalisierten tonisch-klonischen Anfällen. Da das Krankheitsbild der Patienten typisch für Succinat-Semialdehyd-Dehydrogense (SSADH)-Defizienz ist, welche durch Mutationen in ALDH5A1 verursacht wird, wurde dieses Gen im Indexpatienten sequenziert. Hierbei wurde die bisher nicht bekannte Missense-Mutation c.901A > G [p.K301E] in ALDH5A1 identifiziert. In silico-Protein-Modellierung dieser Mutation zeigte, dass p.K301E vermutlich zum Verlust der Fähigkeit NAD+ zu binden führt. Zusätzlich konnte berechnet werden, dass die Mutation eine deutliche Abnahme der freien Energie verursacht und damit zu einer starken Destabilisierung von SSADH führen kann. Übereinstimmend mit diesen Vorhersagen wurde der Verlust der SSADH-Enzymaktivität bei unterschiedlichen NAD +–Konzentrationen in Proteinextrakten aus Lymphoblasten eines Patienten aus Familie 8600485 nachgewiesen. Die Mutation p.K301E ist erst die zweite Missense-Mutation, welche die Bindung von NAD+ an SSADH beeinträchtigt und zu nicht nachweisbarer SSADH-Aktivität führt