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Efeito da curcumina no tratamento de micróglias infectadas pelo vírus Zika
Dissertação (mestrado) — Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Pós-graduação em Medicina Tropical, 2021.O relato de numerosos casos de microcefalia no Brasil entre 2015 e 2016
alertou a comunidade científica mundial. O principal motivo foi a sua relação com
os casos de infecção pelo vírus Zika. A organização mundial da saúde alertou
para a necessidade do desenvolvimento de tratamentos para a infecção e
prevenções ao desenvolvimento da microcefalia. Neste contexto, a curcumina
tem se mostrado uma molécula de interesse para estudos com o vírus Zika, pois
há na literatura evidências da sua ação sobre os flavivírus e já está demonstrada
sua capacidade anti-inflamatória. Portanto, o objetivo deste trabalho foi avaliar
se a curcumina tem a capacidade de interferir nos mecanismos de morte celular
e de autofagia induzidos pelo vírus e se esta molécula possui ação
imunomoduladora, importante na prevenção da neuroinflamação que ocorre
durante a infecção. A melhor compreensão destes mecanismos poderá contribuir
para o desenvolvimento de novas medidas terapêuticas e diminuir a morbidade
da infecção pelo vírus Zika. As micróglias murinas de linhagem BV2 foram
infectadas com MOI 0,1 e MOI 1 do vírus Zika (cepa PE/243) e tratadas com
0,31 μM, 0,62 μM, 1,25 μM, 2,5 μM e 5 μM de curcumina. A viabilidade celular
foi avaliada pelo teste de redução do MTT e lida em espectrofotômetro. A
expressão da caspase-3, da mTOR e da LC3 foram avaliadas por teste antígeno-
anticorpo por citometria de fluxo. A morte celular foi avaliada pela marcação por
anexina/iodeto de propídio, lido em citometria de fluxo. A produção de espécies
reativas de oxigênio e de nitrogênio foram avaliadas pelas sondas DCF-DA e
DAF-FM, respectivamente, em citometria de fluxo. A dosagem das citocinas foi
realizada por kit CBA (BD), em citometria de fluxo. Os dados mostraram que o
vírus Zika apresentou um efeito citopático sobre as células BV2 e a curcumina
reverteu parcialmente esta citotoxicidade. Este efeito citopático do vírus foi
resultado principalmente da indução da apoptose sem aumentar a produção de
caspase-3 pelas micróglias. Já a curcumina, mesmo sem alterar o número de
células apoptóticas, reduziu a sinalização pela caspase-3. Observamos também
que o vírus Zika induz a autofagia nas micróglias sem alterar a expressão de
mTOR, enquanto o tratamento com a curcumina induziu ainda mais a autofagia
através da redução da expressão de mTOR. O vírus Zika induziu uma resposta
inflamatória pelas células BV2 com aumento da produção de IFN-γ, TNF-α, IL-6,
IL-10, IL-17, MCP-1. Esta resposta inflamatória foi controlada pela curcumina,
reduzindo a produção de IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17, IFN-γ e TNF-α nos grupos
de células infectadas com MOI 0,1 do vírus e que receberam o tratamento de
2,5 μM e 5 μM. Por fim, observamos que a infecção aumentou a produção de
EROs pelas células BV2. Apenas as células estimuladas com MOI 0,1
apresentaram a produção aumentada de ERNS. Em contrapartida, células na
presença de MOI 1 produziram menos ERNs. Em conclusão, observou-se que o
tratamento com a curcumina apresentou um efeito pró-oxidante durante a
infecção pelo vírus Zika.The report of numerous cases of microcephaly in Brazil between 2015 and
2016 have alerted the world scientific community. The main reason for it was the
relation between cases of infection by zika virus. The World Health Organization
alerted the need of development of treatments for the microcephaly infection and
prevention. On this context, curcumin has shown itself as an interesting molecule
for studies with zika virus because it has evidences of its action above flavivirus
and anti-inflammatory capacity all over the literature. Therefore, the aim of the
present work has been to analyze if curcumin interfered on cell death and
autophagy pathways induced by the virus and if this molecule has
immunomodulator action, which is important for the prevention of the
neuroinflammation that happens during the infection. The best understanding of
these pathways can contribute for the development of new therapeutic measures
and decrease the morbidity of zika virus infection. The BV2 cell line of murine
microglia were infected by MOI 0,1 e MOI 1 of zika virus (strain PE/243) and
treated with 0.31 μM, 0.62 μM, 1.25 μM, 2.5 μM and 5 μM of curcumin. The
cellular viability was evaluated by the test of MTT reduction and read in
spectrophotometer. The expression of caspase-3, mTOR and LC3 has been
evaluated by antigen-antibody test and read in flow cytometry. The cell death was
evaluated by annexin/propidium iodide target and also read in flow cytometry.
The production of reactive oxygen species and nitrogen was evaluated by DCF-
DA and DAF-FM probes, respectively, in flow cytometry. The cytokine dosage
has been done by CBA kit (BD) in flow cytometry. Our data has shown that zika
virus presented a cytopathic effect in BV2 cells and curcumin has partly reversed
this cytotoxicity. This cytopathic effect of the virus has happed mainly because of
the induction of cell apoptosis, without increasing the production of caspase-3 by
microglia. Curcumin, on the other hand, even without changing the number of
apoptotic cells, has reduced the signaling by caspase-3. We also have observed
that zika virus induced autophagy on microglia without changing mTOR
expression, while the treatment with curcumin induced even more autophagy by
the reduction of mTOR expression. Zika virus induced an inflammatory response
by BV2 cells with an increase on IFN- γ, TNF-α, IL-6, IL-10, IL1-17, MCP-1
production. This inflammatory response has been controlled by curcumin,
decreasing IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17, IFN-γ and TNF- α production on groups
of cells infected by virus MOI 0,1 which received the treatment of 2,5 μM and
5 μM. In the end. We have observed that the infection increased EROs production
by the BV2 cells. In addiction, only cells stimulated by small amount of virus has
shown increasing of ERNs production. On the other hand, cells infected by large
amount of virus produced less ERNs. We have seen that the treatment with
curcumin presented a pro-oxidant effect during zika virus infection
ACW-02 an Acridine Triazolidine Derivative Presents Antileishmanial Activity Mediated by DNA Interaction and Immunomodulation
The present study proposed the synthesis of a novel acridine derivative not yet described in the literature, chemical characterization by NMR, MS, and IR, followed by investigations of its antileishmanial potential. In vitro assays were performed to assess its antileishmanial activity against L. amazonensis strains and cytotoxicity against macrophages through MTT assay and annexin V-FITC/PI, and the ability to perform an immunomodulatory action using CBA. To investigate possible molecular targets, its interaction with DNA in vitro and in silico targets were evaluated. As results, the compound showed good antileishmanial activity, with IC50 of 6.57 (amastigotes) and 94.97 (promastigotes) µg mL−1, associated with non-cytotoxicity to macrophages (CC50 > 256.00 µg mL−1). When assessed by flow cytometry, 99.8% of macrophages remained viable. The compound induced an antileishmanial effect in infected macrophages and altered TNF-α, IL-10 and IL-6 expression, suggesting a slight immunomodulatory activity. DNA assay showed an interaction with the minor grooves due to the hyperchromic effect of 47.53% and Kb 1.17 × 106 M−1, and was sustained by docking studies. Molecular dynamics simulations and MM-PBSA calculations propose cysteine protease B as a possible target. Therefore, this study demonstrates that the new compound is a promising molecule and contributes as a model for future works