Papel da Glicoproteína G do vírus da Raiva na Indução de Apoptose

Tese de mestrado, Microbiologia Aplicada, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2019A Raiva é uma zoonose causada por um vírus neurotrópico pertencente ao género Lyssavirus, família Rhabdoviridae, ordem Mononegavirales. Este vírus infecta todas as espécies de animais de sangue quente. Este trabalho teve como principal objectivo avaliar a influência da glicoproteína G do vírus da raiva na replicação em células de neuroblastoma murino Neuro2a cultivadas in vitro, assim como na indução da apoptose. Foram comparados dois genótipos distintos, genótipo 1 (CVS-11, estirpe fixa, atenuada in vitro por passagens seriadas em culturas celulares BHK-21, e CVS-27, estirpe fixa, atenuada in vivo por passagens seriadas em cérebro de ratinho lactante) e genótipo 5 (EBLV-1, estirpe selvagem de quirópteros isolada em células de neuroblastoma). A cinética de replicação dos vírus em estudo foi avaliada por transcrição reversa seguida de PCR quantitativo (RTqPCR), e expressão das proteínas N (precoce) e G (tardia) por imunofluorescência. A apoptose foi avaliada através da visualização em gel das alterações do DNA celular sujeito a electroforese. Foram encontradas diferenças significativas na expressão das proteínas N e G, quer entre as duas estirpes fixas estudadas, quer entre as estirpes fixas e a estirpe isolada a partir de morcegos. A expressão de proteína N mostrou-se mais precoce em CVS-27 que em CVS-11, sugerindo que o ciclo replicativo da primeira estirpe seja mais curto que o da última. A expressão de G foi observada mais tardiamente, estando em conformidade com o facto de que a sua expressão só ocorre no final do ciclo replicativo. A expressão das proteínas N e G de EBLV-1 foi observada apenas às 24 h p.i., com fraca intensidade de fluorescência e com um número mais reduzido de células infectadas, o que evidencia uma evolução de infecção mais lenta e gradual desta estirpe na linha celular utilizada neste trabalho quando comparada com as estirpes fixas. No seu todo, estes resultados sugerem que a duração do ciclo replicativo depende da susceptibilidade e permissibilidade do sistema celular à infecção pelas diferentes estirpes de vírus da raiva. Os ensaios de apoptose induzida pela infecção destes Lyssavírus, embora preliminares, sugerem que a estirpe EBLV-1 seja a mais apoptótica das estirpes estudadas.Rabies is a zoonosis caused by a neurotropic virus belonging to the genus Lyssavirus, family Rhabdoviridae, order Mononegavirales. This virus infects all species of warmblooded animals. This study aimed to evaluate the influence of rabies virus glycoprotein G on the viral replication in in vitro cultured murine neuroblastoma cells, as well as on the induction of apoptosis. Two distinct genotypes were compared, genotype 1 (CVS-11, fixed strain, attenuated by serial passages in BHK-21 cell cultures, and CVS-27, fixed strain, attenuated in vivo by serial passages in lactating mouse brain) and genotype 5 (EBLV-1, wild chiropteran strain isolated on neuroblastoma cells). The replication kinetics of the studied viruses were evaluated by reverse transcription followed by quantitative PCR (RT-qPCR), and expression of N (early) and G (late) proteins by immunofluorescence. Apoptosis was assessed by gel visualization of cell DNA changes. Significant differences were found in the expression of N and G proteins, both between the two fixed strains studied and between the fixed strains and the strain isolated from bats. Protein N expression was earlier in CVS-27 than in CVS-11, suggesting that the replicative cycle of the first strain is shorter than the last. G expression was observed later, in line with the fact that its expression only occurs at the end of the replicative cycle. The expression of EBLV-1 N and G proteins was observed only at 24 h pi, with low fluorescence intensity and with a smaller number of infected cells, which shows a slower and more gradual evolution of this strain in the cell line used in this work when compared to fixed strains. Overall, these results suggest that the duration of the replicative cycle depends on the susceptibility and permissibility of the cellular system to infection by different strains of rabies virus. Apoptosis assays induced by infection of these Lyssaviruses, although preliminary, suggest that the EBLV-1 strain is the most apoptotic of the studied strains