Fabrication of bradykinin nanostructures mediated by DNA

Introdução: A bradicinina (BK) é um peptídeo-hormônio com a seguinte sequência de aminoácidos: RPPGFSPFR (R: arginina, P: prolina, G: glicina, S: serina, F: fenilalanina). A BK está relacionada às proteínas cininas, possuindo efeito vasodilatador e estando diretamente ligada à liberação de mediadores inflamatórios. Por isso uma grande quantidade de estudos acerca da BK explora seu potencial como redutor de pressão arterial, sendo que sua aplicação já está bem estabelecida na indústria farmacêutica como princípio ativo para fármacos anti-hipertensivos. Por outro lado, mesmo que esse mecanismo já esteja bem estabelecido, ainda não há estudos utilizando materiais nanoestruturados da BK ou investigando se essas nanoestruturas apresentam a ação biológica do peptídeo nativo. Além da BK, um análogo importante é a des-Arg9-BK (DBK), cuja sequência é quase idêntica à da BK, porém com ausência de uma arginina na posição 9. A DBK também exerce um mecanismo de ação diferenciado da BK, sendo um agonista do receptor β1. Objetivo: O objetivo deste projeto foi produzir arranjos supramoleculares de BK e analisar se essas nanoestruturas exercem respostas celulares semelhantes (ou melhoradas) às do peptídeo em sua forma nativa. Métodos: Peptídeos BK e DBK foram solubilizados em meio aquoso na presença ou ausência de cadeias curtas de DNA contendo cerca de 200 pb. Essas soluções foram caracterizadas por métodos de fluorescência para determinação de concentrações de agregação críticas, enquanto a estrutura secundária foi analisada em experimentos de dicroísmo circular. A morfologia dos agregados foi observada via microscopia eletrônica e microscopia de força atômica. Análises em solução foram realizadas por meio de espalhamento de raios X a baixo ângulo, e a resposta celular foi avaliada pelo monitoramento de influxo de cálcio em células HUVEC. Resultados: Experimentos de fluorescência demostraram que na presença do DNA os peptídeos formam agregados em concentrações muito menores do que as observadas em sua ausência. Além disso, também foi possível observar um deslocamento do comprimento de emissão máxima na presença do DNA, o que é interpretado como indicador da formação de agregados nanoscópicos. Dados de microscopia eletrônica mostram que em concentrações acima de ~1.3 mg/ml, a BK forma agregados irregulares de dimensões reduzidas enquanto na presença de DNA ocorre a formação de nanofibrilas com comprimentos que atingem a escala de micrômetros, mostrando que o DNA é um excelente molde para a agregação do peptídeo. Também foi possível inferir a região de ligação dos peptídeos no DNA, monitorando espectros de emissão em ensaios de titulação. Para isso, usamos como referência as emissões de EtBr e de SYBR. Esses ensaios demonstraram que a BK se liga preferencialmente à região minor groove do DNA, enquanto a DBK é um intercalante entre bases. Respostas celulares também foram vistas em experimentos de influxo de cálcio, onde se observou que tanto a BK quanto o complexo BK-DNA induzem a entrada de cálcio, indicando que as nanoestruturas formadas preservam a função do peptídeo original. No caso da DBK, não foi observada a formação de agregados regulares nem qualquer resposta de influxo de cálcio. Conclusão: Demonstramos a produção inédita de nanoestruturas ordenadas baseadas em BK e identificamos a região de ligação entre esse peptídeo e o DNA. Demonstramos também que a capacidade da BK de promover influxo de cálcio é preservada nas nanoestruturas geradas. Esses achados levam à perspectiva de que nanoestruturas de BK podem ser utilizadas para a formulação de biomateriais nanoestruturados com propriedades hipotensoras.Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)FAPESP-19/20907-7CAPES-001CNPq - 409455/2018-

Amyloid-like self-assembly of a hydrophobic cell-penetrating peptide and its use as a carrier for nucleic acids

Cell-penetrating peptides (CPPs) are a topic subject potentially exploitable for creating new nanotherapeutics for the delivery of bioactive loads. These compounds are often classified into three major categories according to their physicochemical characteristics: cationic, amphiphilic, and hydrophobic. Among them, the group of hydrophobic CPPs has received increasing attention in recent years due to toxicity concerns posed by highly cationic CPPs. The hexapeptide PFVYLI (P: proline, F: phenylalanine, V: valine, Y: tyrosine, L: leucine and I: isoleucine), a fragment derived from the C-terminal portion of α1-antitrypsin, is a prototypal example of hydrophobic CPP. This sequence shows reduced cytotoxicity, capacity of nuclear localization, and its small size readily hints suitability as a building block to construct nanostructured materials. In this study, we examine the self-assembling properties of PFVYLI and investigate its ability to form non-covalent complexes with nucleic acids. By using a combination of biophysical tools including synchrotron small-angle X-ray scattering and atomic force microscopy-based infrared spectroscopy, we discovered that this CPP self-assembles into discrete nanofibrils with remarkable amyloidogenic features. Over the course of days, these fibrils coalesce into rod-like crystals that easily reach the micrometer range. Despite lacking cationic residues in the composition, PFVYLI forms non-covalent complexes with nucleic acids that retain -sheet pairing found in amyloid aggregates. In vitro vectorization experiments performed with double-stranded DNA fragments indicate that complexes promote the internalization of nucleic acids, revealing that tropism toward cell membranes is preserved upon complexation. On the other hand, transfection assays with splice-correction oligonucleotides (SCOs) for luciferase expression show limited bioactivity across a narrow concentration window, suggesting that propensity to form amyloidogenic aggregates may trigger endosomal entrapment. We anticipate that the findings presented here open perspectives for using this archetypical hydrophobic CPP in the fabrication of nanostructured scaffolds, which potentially integrate properties of amyloids and translocation capabilities of CPPs.Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)19/20907-