CRISPR-transient expression in soybean for simplified gRNA screening in planta

O objetivo deste trabalho foi desenvolver um método para criar e validar sistemas CRISPR-Cas e diferentes gRNAs em embriões de soja (Glycine max). Dois genes modelo foram usados para mutação simples com um gRNA ou deleção parcial do gene com dois guias. Os gRNAs foram inseridos nos vetores de transformação CRISPR por uma enzima de restrição do tipo IIS ou por subclonagem e inserção do promotor + gRNA2 no vetor de transformação final, com uso do método clássico de clonagem por enzimas de restrição. Os vetores foram construídos com sucesso para um e dois gRNAs. A transformação transiente de soja por Agrobacterium foi realizada para testar a qualidade dos gRNAs e do próprio sistema (cassete de expressão). Detectaram-se mutação simples e deleção gênica nos embriões transformados após o enriquecimento do DNA por digestão seguida de reação em cadeia da polimerase e sequenciamento, o que indica que o sistema CRISPR-Cas e os guias estavam funcionando. Este protocolo pode ser usado para acelerar as estratégias de edição de genoma baseadas em CRISPR, para transformação genética em soja.The objective of this work was to develop a method to create and validate CRISPR-Cas systems and different gRNAs in soybean (Glycine max) embryos. Two model genes were used for simple mutation with one gRNA or partial gene deletion with two guides. The gRNAs were inserted into the CRISPR transformation vectors by a type IIS restriction enzyme or by subcloning and inserting the promoter + gRNA2 in the final transformation vector using the classic restriction enzyme cloning method. The vectors were successfully constructed for one and two gRNAs. Agrobacterium-mediated transient transformation in soybean was carried out to test the quality of gRNAs and of the system itself (expression cassette). Simple mutation and gene deletion were detected in the embryos transformed after DNA enrichment by enzyme digestion followed by polymerase chain reaction and sequencing, which indicates that the CRISPR-Cas system and guides were working. This protocol can be used to accelerate CRISPR-based genome editing strategies for genetic transformation in soybean

Tolerância à seca em cultivares-elite de soja com a introgressão do transgene AtAREB1

The objective of this work was to verify if the introgression of the AtAREB1 gene in the 'LS93-0375' and 'BMX Desafio RR' elite soybean germplasms increases the tolerance of these plants to water deficit. The F4 progenies of these two elite cultivars and of the AtAREB1 transgenic line (BR16-AtAREB1) and its background ('BR16') were subjected to water deficit assays. The water deficit bioassays were performed in a greenhouse using the following six soybean lines: the genetically modified BR16-AtAREB1 and its background 'BR16'; 'LS93' and its F4 progeny, LS93-AtAREB1; and 'BMX Desafio RR' and its F4 progeny, Desafio-AtAREB1. A randomized complete block experimental design was carried out in a 6x2 factorial arrangement, with  the six soybean genotypes and two water conditions – control (C) and water deficit (WD) treatments – with nine replicates. Soybean genotypes containing the AtAREB1 gene showed better physiological performances under drought stress and altered expressions of drought-responsive genes. The intogression of AtAREB1 in soybean increases the plant drought tolerance, regardless of the genetic background in which the gene was introduced.O objetivo deste trabalho foi verificar se a introgressão do gene AtAREB1 em dois germoplasmas-elite de soja, 'LS93-0375' e 'BMX Desafio RR', aumenta a tolerância dessas plantas ao deficit hídrico. As progênies F4 das duas cultivares-elite e da linhagem transgênica AtAREB1 (BR16-AtAREB1) e de seu background ('BR16') foram submetidas a deficit hídrico. Os bioensaios de deficit hídrico foram realizados em casa de vegetação, tendo-se utilizado as seis seguintes linhagens de soja: a geneticamente modificada BR16-AtAREB1 e seu background 'BR16'; 'LS93' e sua progênie F4, LS93-AtAREB1; e 'BMX Desafio RR' e sua progênie F4, Desafio-AtAREB1. Utilizou-se delineamento experimental de blocos completos com tratamentos casualizados, em arranjo fatorial 6x2, com os seis genótipos de soja e duas condições hídricas – controle (C) e tratamentos de deficit hídrico (WD) –, com nove repetições. Os genótipos de soja que contêm o gene AtAREB1 exibiram melhor desempenho fisiológico sob estresse hídrico e expressão alterada de genes responsivos à seca. A introgressão de AtAREB1 na soja aumenta a tolerância à seca, independentemente do background genético em que o gene foi introduzido

Tamanho de amostra para determinação da condutividade elétrica individual de sementes de girassol

RESUMO O teste de condutividade elétrica é um teste de vigor de sementes utilizado para avaliar a qualidade das sementes e complementar o teste de germinação. O tamanho da amostra necessária para a estimação da média de condutividade elétrica de sementes é diretamente proporcional à variabilidade dos dados e confiabilidade desejada na estimativa. Uma técnica adequada para dimensionamento amostral é a utilização de intervalos de confiança, obtidos por reamostragem, com a vantagem de não dependerem da distribuição de probabilidade dos dados. O objetivo deste trabalho foi estimar o tamanho de amostra necessário para o teste de condutividade elétrica individual em sementes de girassol. Foram utilizados 7 lotes de sementes de girassol, sendo 3 da cultivar Hélio 250, 2 da cultivar BRS 323 e 2 da cultivar BRS 324. O teste de condutividade elétrica individual foi realizado com 400 sementes de cada lote, e o tamanho de amostra foi determinado pelo número de sementes a partir do qual a amplitude do intervalo de confiança de 95% (AIC95%) foi menor ou igual a 15, 20, 25, 30 e 35% da estimativa da média. O tamanho de amostra de 483, 257, 172, 115 e 85 sementes é suficiente para a estimativa da média de condutividade elétrica individual de sementes de girassol com AIC95% igual a 15, 20, 25, 30 e 35% da estimativa da média, respectivamente, para todos os lotes e períodos de embebição

Análise estrutural de vagens e sementes de soja submetidas à deterioração por umidade em pré-colheita

The objective of this work was to analyze structurally the pods and seed coats of soybean (Glycine max) cultivars, as well as to determine the quality of seeds when subjected to deterioration by weathering in pre-harvest. A 7×3 factorial arrangement was used – seven cultivars and three volumes of simulated rainfall (0, 54, and 162 mm). Exposure to rainfall was simulated in the R8 phenological stage. Then, the plants were taken to a greenhouse, where they were kept until the time of collection of pods and seeds. After collection, the following evaluations were carried out: tetrazolium test, lignin content in pods and seed coats, and structural analysis of pods (exocarp, mesocarp, and endocarp thickness) and seed coats (epidermis, hypodermis, and parenchymal-cell thickness). Pre-harvest rainfall of 54 and 162 mm reduces the quality of soybean seeds; however, the response to deterioration by weathering differs according to the cultivar. The tolerance to all simulated rainfall was greater for BRSMT Pintado, BRS Jiripoca, and M8210IPRO and lower for BRS 1010IPRO. Pods with a greater thickness of the exocarp, mesocarp, and endocarp and a high lignin content show greater resistance to weathering deterioration and seeds with greater vigor and viability. The thickness of the hypodermis of the testa is related to resistance to weathering deterioration and to the obtainment of high-quality seeds.O objetivo deste trabalho foi analisar estruturalmente as vagens e os tegumentos de cultivares de soja (Glycine max), bem com determinar a qualidade das sementes quando submetidas à deterioração por umidade em pré-colheita. Utilizou-se arranjo fatorial 7×3 – sete cultivares e três volumes de precipitações pluviais simuladas (0, 54 e 162 mm). A exposição à chuva foi simulada no estádio fenológico R8. Em seguida, as plantas foram levadas à casa de vegetação, onde foram mantidas até a coleta das vagens e das sementes. Após a coleta, realizaram-se as seguintes avaliações: teste de tetrazólio, teor de lignina nas vagens e nos tegumentos, e análise estrutural de vagens (espessura do exocarpo, do mesocarpo e do endocarpo) e tegumentos (espessura da epiderme, da hipoderme e das células parenquimatosas). Precipitações de 54 e 162 mm em pré-colheita reduzem a qualidade das sementes de soja; entretanto, a resposta à deterioração por umidade difere de acordo com a cultivar. A tolerância a todas as precipitações pluviais simuladas foi maior para BRSMT Pintado, BRS Jiripoca e M8210IPRO e menor para BRS 1010IPRO. Vagens com maior espessura do exocarpo, do mesocarpo e do endocarpo e elevados teores de lignina apresentam maior tolerância à deterioração por umidade e sementes com maior vigor e viabilidade. A espessura da hipoderme da testa de tegumentos está relacionada à tolerância à deterioração por umidade e à obtenção de sementes de elevada qualidade

Redução populacional de trigo no rendimento e na qualidade fisiológica das sementes

Na produção de sementes de trigo diversos fatores (bióticos e abióticos) podem alterar o rendimento e a qualidade de sementes, dentre esses cita-se o estabelecimento adequado das plantas no campo. Dessa forma, objetivou-se com esse trabalho verificar o efeito da redução da população de trigo de forma aleatória no rendimento e na qualidade fisiológica das sementes produzidas. O estudo foi realizado nas cultivares Horizonte, Marfim, Mirante e Quartzo. Anteriormente à fase do afilhamento, procedeu-se a retirada de plantas de maneira aleatória nas intensidades de 0; 20; 40 e 60% em relação à população original (350 plantas por metro quadrado). Após a colheita, avaliou-se o rendimento e a qualidade das sementes produzidas, por meio dos testes de germinação, envelhecimento acelerado, condutividade elétrica massal e massa de mil sementes. Verificou-se que as cultivares apresentam desempenho diferente quando submetidas a reduções aleatórias de plantas demonstrando capacidades distintas em compensar eventuais falhas na semeadura. A resposta para rendimento de trigo em função da redução aleatória na população de plantas varia conforme o genótipo utilizado. Quanto à qualidade das sementes produzidas, reduções aleatória de plantas de trigo afetam negativamente a qualidade fisiológica das sementes

Physiological quality of soybean seeds treated with different spray volumes

The aim of this study was to define the influence of treatments with different seed spray volumes and their effects on the physical and physiological quality. The soybean seeds from cultivars NA 5909 RG and BMX Potência RR were used and three lots of each cultivar were selected in sieves of different diameters (5.5; 6.0 and 6.5 mm). The treatments consisted of different seed volumes: 1) non-treated seeds; 2) 600 mL.100 kg of seeds-1; 3) 800 mL.100 kg of seeds-1; 4) 1000 mL.100 kg of seeds-1; 5) 1200 mL.100 kg of seeds-1; 6) 1400 mL.100 kg of seeds-1. The physical parameters evaluated were mechanical damage, water content and variations in the length and width of the seeds. The physiological seed quality was determined by germination, first count germination, length and dry weight of seedlings, field emergence and emergence speed index tests. In terms of use of the product in liquid form, it is possible to use the treatment in spray volumes up to 1400 mL.100 kg seed-1, regardless the cultivar or seed size and without damaging the soybean seeds physically and physiologically

Cytogenetic analysis of wheat seeds submitted to artificial aging stress

Several studies have been developed to understand the physiology of seed deterioration, however, the initial steps of the deterioration process are not completely clear. Seed vigor and viability losses are also associated with genetic material damage. This study was carried out to detect cytogenetic and physiological alterations occurring during the deterioration process of wheat seeds, due to artificial aging stress. Two cultivars, Ônix and Fundacep Campo Real, were submitted to six different treatments: control (T1), 24 (T2), 48 (T3), 72 (T4), 96 (T5) and 120 (T6) hours under artificial aging conditions: 42 °C and 100% relative humidity. Germination and vigor tests (First Count of Germination, Electrical Conductivity, Seedling Emergence in the Field and Emergence Speed Index) were performed. Cytogenetic evaluations were performed through smear technique for root tips, stained with 2% acetic orcein. Total number of cells under division and mitotic index (MI) were determined. According to results, vigor and mitotic index were affected due to deterioration process induced by artificial aging stress. A reduced number of dividing cells were observed in seeds submitted to prolonged period of aging. Chromosomal abnormalities in mitotic cells of aged seeds were detected with the occurrence of micronuclei, chromosome breaks and bridges