Rapid detection of copy number variations and point mutations in BRCA1/2 genes using a single workflow by ion semiconductor sequencing pipeline

Molecular analysis of BRCA1 (MIM# 604370) and BRCA2 (MIM #600185) genes is essential for familial breast and ovarian cancer prevention and treatment. An efficient, rapid, cost-effective accurate strategy for the detection of pathogenic variants is crucial. Mutations detection of BRCA1/2 genes includes screening for single nucleotide variants (SNVs), small insertions or deletions (indels), and Copy Number Variations (CNVs). Sanger sequencing is unable to identify CNVs and therefore Multiplex Ligation Probe amplification (MLPA) or Multiplex Amplicon Quantification (MAQ) is used to complete the BRCA1/2 genes analysis. The rapid evolution of Next Generation Sequencing (NGS) technologies allows the search for point mutations and CNVs with a single platform and workflow. In this study we test the possibilities of NGS technology to simultaneously detect point mutations and CNVs in BRCA1/2 genes, using the OncomineTM BRCA Research Assay on Personal Genome Machine (PGM) Platform with Ion Reporter Software for sequencing data analysis (Thermo Fisher Scientific). Comparison between the NGS-CNVs, MLPA and MAQ results shows how the NGS approach is the most complete and fast method for the simultaneous detection of all BRCA mutations, avoiding the usual time consuming multistep approach in the routine diagnostic testing of hereditary breast and ovarian cancers

Varianti alleliche del gene notch3 in un paziente con sospetto cadasil

L’arteriopatia cerebrale autosomica dominante con infarti subcorticali e leucoencefalopatia (CADASIL, MIM#125310) è la forma ereditaria più comune di arteriopatia sistemica non-amiloide. Può manifestarsi a partire dalla seconda decade di vita con attacchi ischemici subcorticali ricorrenti, decadimento cognitivo, alterazioni dell'umore, emicrania, estese lesioni della sostanza bianca evidenziabili alla risonanza magnetica per immagini (MRI) ed accumulo di granuli elettrondensi (GOM) nella tunica media delle arteriole. CADASIL è causata da mutazioni nel gene Notch3, che determinano l’acquisto o la perdita di residui di cisteina, con conseguente alterazione strutturale della proteina prodotta. Poche informazioni si hanno invece sulle altre varianti missenso e sul loro ruolo nello sviluppo della malattia. In questo studio vengono riferiti i risultati dell’indagine molecolare del gene Notch3 condotta sul DNA di una paziente di 38 anni, proveniente dal Congo, giunta alla nostra osservazione con storia di emicrania sin dall’adolescenza, episodi di offuscamento del visus e brevi parestesie in emisoma dx. Alla MRI risultavano lesioni sottocorticali bilaterali interpretate come esiti gliotici. Veniva formulato il sospetto diagnostico di CADASIL e richiesta l’analisi di mutazione del gene Notch3. L’analisi molecolare mediante sequenziamento diretto di tutti gli esoni del gene ha permesso di identificare due variazioni di sequenza, A1020P (c.3058G>C) e V1183M (c.35474G>A), rispettivamente negli esoni 19 e 22, domini 26 e 30 di EGFR (epidermal growth factor-like repeat). Tali varianti non coinvolgono residui di cisteina e sono state classificate come polimorfismi, tuttavia dall’analisi mediante software predittivi (SIFT e POLYPHEN), V1183M risulta a probabile significato patogenetico e A1020P risulta tollerata. Attualmente ci sono dati controversi sul significato patogenetico delle varianti e ci sono pochi dati circa la correlazione genotipo-fenotipo. Non possiamo ritenere con certezza che queste due varianti siano causative della patologia, è possibile però che insieme possano avere un effetto additivo e dare origine a forme moderate di CADASIL. Ulteriori indagini sono necessarie per capire se alterazioni in altri geni possano contribuire al fenotipo clinico.The cerebral autosomal dominant arteriopathy with subcortical infarcts and leukoencephalopathy ( CADASIL , MIM # 125310 ) is the most common inherited form of systemic arterial disorder. CADASIL is caused by mutations in the Notch3 gene, which lead to a gain or loss of cysteine residues, resulting in structural alteration of the protein produced. Little is known about other missense variants and their role in disease development. This study reported the results of Notch3 gene in a patient of 38 years, from the Congo, with history of migraine since adolescence, incidents of blurring of vision and short paresthesia in emisoma dx. Molecular analysis by direct sequencing of all exons of the gene has identified two sequence variations, A1020P ( c.3058G > C ) and V1183M ( c.35474G > A), exons 19 and 22 respectively, in domains 26 and 30 of EGFR (Epidermal Growth Factor -like Repeat). Currently there are controversial data on the significance of these pathogenic variants and there are few data about their genotype-phenotype correlation. We can not be certain that these two variants are causative of the disease, it is possible, however, that together may have an additive effect and result in moderate forms of CADASIL. Further investigations are needed to understand whether alterations in other genes may contribute to the clinical phenotype

ANALISI DI MUTAZIONE DEI GENI BRCA1/2 IN FAMIGLIE CON TUMORE DELLA MAMMELLA EREDITARIO

Il carcinoma mammario ereditario rappresenta il 5-10% di tutte le neoplasie mammarie. I test genetici per la ricerca di mutazioni nei geni BRCA1 (MIM#113705) e BRCA2 (MIM# 600185) consentono, all’interno delle famiglie con evidente predisposizione ereditaria al cancro della mammella, l’identificazione dei portatori, che devono essere indirizzati agli opportuni programmi di sorveglianza e/o prevenzione. Negli anni 2007-2011 presso la U.O. di Genetica Medica dell’Azienda Ospedaliera Sant’Andrea sono state effettuate 138 consulenze genetiche oncologiche (CGO) in pazienti affette da carcinoma mammario o con familiarità per tumore della mammella. Nell’ambito della CGO è stata valutata l’eleggibilità delle pazienti al test genetico per la ricerca di mutazione nei geni BRCA1/2 in base alla storia familiare, ai criteri tabellari e a modelli predittivi. La probabilità per ogni paziente di essere portatore di mutazione in uno dei due geni è stata calcolata utilizzando il software BRCAPRO (University of Texas http:// www.stat.duke.edu/~gp/brcapro.html). Il test è stato proposto alle pazienti la cui probabilità di mutazione è risultata >10%; in sede di CGO sono risultate eleggibili al test 82 pazienti (60%). La ricerca delle mutazioni predisponenti nei geni BRCA1/2 è stata condotta mediante sequenziamento diretto degli esoni codificanti e delle regioni introniche adiacenti (+/-20bp). L’analisi MLPA per la ricerca di riarrangiamenti genomici è ancora in corso. Il 16% dei pazienti selezionati per il test sono risultati portatori di mutazione patogenetica: 5 nel gene BRCA1 e 8 nel gene BRCA2. Sono state inoltre identificate 23 varianti alleliche nel gene BRCA1, di cui 3 UV (varianti a significato patogenetico incerto) localizzate negli esoni codificanti +/-20bp e 44 varianti nel gene BRCA2, di cui 15 UV localizzate negli esoni codificanti +/-20bp. L’interpretazione del risultato e la consegna del referto in sede di consulenza ha completato il percorso diagnostico ed indirizzato la paziente, a seconda del risultato ottenuto, verso l’appropriata sorveglianza oncologica

Caratterizzazione molecolare di pazienti italiani affetti da Atassia con Aprassia Oculomotoria di tipo 1 (AOA1)

L’Atassia con Aprassia Oculomotoria di tipo 1 (AOA1) è una malattia a trasmissione autosomica recessiva spesso diagnosticata come Atassia Telangiectasia (AT) per la similarità del quadro neurologico. La diagnosi differenziale tra AT e AOA1 è difficile soprattutto nel paziente molto giovane; l’assenza di coinvolgimento sistemico (immunodeficienze, patologia tumorale) e della radiosensibilità insieme a livelli normali di alfafetoproteina sono caratteristiche della AOA1. Tale patologia, inizialmente descritta in una famiglia giapponese e successivamente in diverse famiglie portoghesi, esordisce precocemente con atassia cerebellare, areflessia, aprassia oculomotoria, neuropatia periferica, ritardo mentale e ipoalbuminemia; dopo la pubertà può essere presente ipercolesterolemia. L’assenza di coinvolgimento sistemico rende il decorso meno grave e la sopravvivenza più lunga che nei pazienti AT. Il gene responsabile della malattia, APTX, localizzato sul cromosoma 9p13.3, codifica per l’apratassina, una nucleotide idrolasi trasferasi appartenente alla superfamiglia delle Histidine triad (HIT)-domain proteins probabilmente coinvolta nel riparo delle rotture del DNA a singolo filamento. Le mutazioni finora identificate, per la maggior parte missenso e nonsenso, sono localizzate negli esoni 5, 6 e 7 del gene. In questo studio sono stati riesaminati 25 pazienti non correlati giunti al nostro centro con un sospetto diagnostico di AT ma con test di radiosensibilità ed alfafetoproteina negative e livelli normali di proteina ATM. L’analisi molecolare del gene APTX, condotta mediante Denaturing High-Performance Liquid Chromatography (DHPLC), ha permesso l’identificazione di 6 pazienti AOA1, con tre differenti mutazioni del gene APTX (R247X, L248M, W279X), di cui 2 non precedentemente descritte

Downregulation of the major histocompatibility complex class I molecules by human herpesvirus type 8 and impaired natural killer cell activity in primary effusion lymphoma development

Primary effusion lymphomas (PELs) are invariably infected by human herpesvirus type 8 (HHV8) and often co-infected by Epstein-Barr virus (EBV). We found that expression of major histocompatibility complex class I (MHC-I) surface molecules was significantly decreased in PEL cells when compared with HHV8 negative lymphomas, irrespective of EBV infection. MHC-I downregulation rendered PEL cells sensitive to recognition and killing by natural killer (NK) cells. Intriguingly, analysis of MHC-I non-restricted cytotoxicity in two PEL patients indicated a reduced NK cell activity when compared with healthy individuals. These data suggest that PEL outgrowth may require an impaired NK cell function