Estudio de la conectividad de los circuitos neuronales del bulbo olfatorio de los primates. Comparación de individuos control con casos de Parkinson

La enfermedad de Parkinson es una enfermedad neurodegenerativa multisistémica que afecta al sistema nervioso central y periférico. Caracterizada por la degeneración selectiva de la neuronas dopaminérgicas de la sustancia negra pars compacta (SNpc), se englobada dentro de las llamadas α-sinucleinopatías. El sello distintivo de esta patología es la propagación de agregados proteicos patológicos de α-sinucleína, en forma de cuerpos y neuritas de Lewy, a lo largo de todo el sistema nervioso. La sintomatología con la que cursa esta enfermedad puede clasificarse en dos grandes categorías: síntomas no motores o pre-clínicos y síntomas motores o clínicos. Cronológicamente, los primeros anteceden a los segundos y en ocasiones pueden aparecer, incluso, décadas antes de las manifestaciones motoras típicas de la enfermedad. Durante mucho tiempo sólo se le ha otorgado importancia a los síntomas motores que caracterizan la enfermedad de Parkinson, como son la bradicinesia, rigidez, temblor en reposo o alteración de los reflejos posturales. No obstante, a lo largo de los últimos tiempos, los síntomas no motores han despertado el interés de los médicos y científicos como potenciales biomarcadores que permitirían realizar un diagnóstico precoz de esta enfermedad neurodegenerativa. Entre la sintomatología no motora más notable y relevante, se encuentra la disfunción olfativa, o hiposmia, asociada a los estadios más incipientes de la enfermedad de Parkinson. Los pacientes presentan alteraciones olfativas a distintos niveles, tanto en tareas de detección, como en tareas de identificación y reconocimiento de distintos odorantes cuando son sometidos a un amplio abanico de tests olfativos. La aparición de este signo es muy temprana –hasta varios años antes de que se produzca la manifestación de los primeros síntomas motores que conducen al diagnóstico de la enfermedad- y se manifiesta en un porcentaje muy elevado de los pacientes de Parkinson (90%), tanto en casos de Parkinson hereditario como en casos de Parkinson esporádico o idiopático. Es interesante destacar que esta proporción supera a la de pacientes que terminan manifestando temblor en reposo, uno de los síntomas cardinales de esta enfermedad (75%). Todo esto pone de manifiesto que poder identificar correctamente la hiposmia es fundamental para realizar un diagnóstico precoz y certero de la enfermedad. Además, descubrir cuáles son las posibles causas de la disfunción olfativa asociada a esta patología es importante para conocer más sobre la etiología y el desarrollo de la enfermedad de Parkinson. Por todo ello, en la actualidad, son muchos los esfuerzos de la comunidad científica dirigidos, por un lado, al desarrollo de potentes tests olfativos que revelen alteraciones en la detección, discriminación o identificación de odorantes. Y, por otro lado, al estudio en profundidad del cerebro olfativo de los pacientes que sufren esta enfermedad o de modelos animales de parkinsonismo, mediante la combinación de técnicas electrofisiológicas, neuroanatómicas o moleculares que ayuden a entender mejor las posibles causas de la hisposmia y la evolución de la enfermedad de Parkinson Puesto que el bulbo olfatorio es la región telencefálica donde se produce el primer relevo sináptico de la información olfativa, es lógico pensar que entre las posibles causas que dan lugar a la disfunción olfatoria que se observa en los pacientes de Parkinson, se encuentren algunas alteraciones en la organización y en la conectividad de los circuitos neuronales del propio bulbo olfatorio. Existen pocos trabajos que estudien las modificaciones neuroantómicas de la vía olfativa durante el desarrollo de la enfermedad de Parkinson. Entre los trabajos publicados que analizan el bulbo olfatorio, algunos han demostrado que la enfermedad provoca la aparición de glomérulos olfatorios ectópicos (Hoogland et al. 2003; Mundiñano et al. 2011) y, otros describen la presencia de cuerpos de Lewy en las células mitrales del bulbo olfatorio (Úbeda-Bañón et al, 2010a). Estudios más recientes, muestran un incremento del 100% en el número de células dopaminérgicas en el bulbo olfatorio tanto en enfermos de Parkinson (Úbeda-Bañón et al, 2004; Carril-Mundiñano et al, 2011) como en el modelo experimental de macacos tratados con 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP) (Belzunegui et al. 2007). Aunque estos antecedentes sugieran que es probable que existan alteraciones en la organización de la circuitería del bulbo olfatorio durante la enfermedad de Parkinson, hasta la fecha, no existe ningún trabajo que se haya encargado de estudiar en detalle cómo es la organización y la conectividad de los circuitos neuronales del bulbo olfatorio en los pacientes con la enfermedad de Parkinson o en modelos animales de parkinsonismo. En este contexto, la presente Tesis Doctoral pretende investigar en qué medida se ven alterados los circuitos neuronales del bulbo olfatorio en un modelo experimental de parkinsonismo. Existe un conjunto amplio de modelos experimentales para estudiar distintos aspectos de la enfermedad de Parkinson. Entre ellos, nosotros hemos elegido el modelo de intoxicación con MPTP en macacos, concretamente en Macaca fascicularis. El principal motivo que nos conduce a esta elección es que los resultados procedentes de macacos son más fácilmente extrapolables a humanos que los que se obtendrían con modelos de roedores. Actualmente, no disponemos de datos acerca de la organización anatómica ni de la conectividad sináptica de los circuitos neuronales del bulbo olfatorio de macacos. Por ello, hemos realizado, en primer lugar, un estudio completo de la organización y del patrón de conectividad de los circuitos neuronales del bulbo olfatorio de Macaca fascicularis. Para ello, hemos combinado técnicas neuroanatómicas clásicas y técnicas inmunocitoquímicas con microscopía óptica, microscopía confocal y microscopía electrónica. A continuación, hemos realizado un estudio comparativo de los circuitos neuronales del bulbo olfatorio de macacos control y macacos parkinsonianos. Para identificar y marcar de manera selectiva las diferentes poblaciones de interneuronas que integran los circuitos neuronales del bulbo olfatorio de Macaca fascicularis en función de sus características neuroquímicas y, poder estudiar el patrón de conectividad sináptica que estas células presentan, hemos utilizado distintos marcadores, como son las proteínas quelantes de calcio calbindina (CB), calretinina (CR) y parvalbúmina (PV), y las enzimas tirosina hidroxilasa (TH) y la isoforma neural de la sintasa del óxido nítrico (nNOS). Los resultados de la primera parte de nuestro trabajo demuestran que existe una conservación filogenética de la organización neuroanatómica, de las caracterísiticas neuroquímicas y de los patrones de conectividad sináptica que presentan los circuitos neuronales del bulbo olfatorio en el macaco (mamífero microsmático) cuando los comparamos con datos previos descritos en roedores (mamíferos macrosmáticos). Los resultados más relevantes de esta primera parte del trabajo se pueden resumir de la siguiente manera. En primer lugar, la conectividad de los circuitos neuronales del bulbo olfatorio de macaco es exactamente igual a la que se ha descrito en el bulbo olfatorio de la rata. Brevemente, las interneuronas de primer orden (células periglomerulares y células granulares) establecen contactos sinápticos dendro-dendríticos con las células principales (células mitrales y células empenachadas) de la siguiente forma, las células principales establecen contactos sinápticos asimétricos sobre las interneuronas y, a su vez, éstas realizan contactos sinápticos simétricos sobre las células principales. En ocasiones, los contactos sinápticos forman pares recíprocos. En segundo lugar, al igual que en el caso de los mamíferos macrosmáticos, en Macaca fascicularis el neuropilo de los glomérulos olfatorios está compartimentalizado y se diferencian dos compartimentos: el compartimento sináptico y el compartimento sensorial. Las células periglomerulares forman, al menos, cuatro subpoblaciones celulares neuroquímicamente no solapadas, que se caracterizan por la expresión de las siguientes proteínas: TH, nNOS, CB y CR; tal y como ocurre en roedores. Tras el estudio de las relaciones sinápticas que establecen las dendritas de estas cuatro subpoblaciones neuronales con los terminales axónicos del nervio olfatorio, hemos podido confirmar que las células periglomerulares que expresan TH y nNOS pertenecen al conjunto de células periglomerulares de tipo 1, cuya característica principal es que reciben contactos sinápticos desde el nervio olfatorio. A su vez, las células periglomerulares que expresan CB y las que expresan CR son células periglomerulares de tipo 2, definidas por no mantener relaciones sinápticas directas con el nervio olfatorio, tal y como ocurre en el neuropilo glomerular de los mamíferos macrosmáticos. En tercer lugar, existen algunas diferencias entre roedores y primates cuando analizamos las interneuronas de la capa plexiforme externa. Por una parte, la población mayoritaria de interneuronas de la capa plexiforme externa de la rata está definida neuroquímicamente por la expresión de la proteína ligante de calcio PV, y establece contactos sinápticos dendro-dendríticos y dendro-somáticos con las células principales. Nosotros, en nuestro estudio en Macaca fascicularis hemos descrito una población de interneuronas que muestra un patrón de conectividad similar al descrito en rata, pero con la diferencia de que, en macacos, estas células expresan las proteínas quelantes de calcio CB y CR en lugar de expresar PV. Por otra parte, en la capa plexiforme externa del bulbo olfatorio de la rata hemos identificado una población de interneuronas que se caracteriza por ser dopaminérgica. Nuestros trabajos demuestran que las interneuronas dopaminérgicas de la capa plexiforme externa de la rata no establecen ninguna relación sináptica con las células principales y tampoco realizan contactos sinápticos desde sus dendritas. En la capa plexiforme externa del macaco, no hemos podido identificar una población de interneuronas dopaminérgicas con estas características. Las únicas células dopaminérgicas que hemos identificado en esta capa han sido algunas células periglomerulares y granulares desplazadas. Todo ello nos permite concluir que la organización de los circuitos de la capa plexiforme externa de los primates (mamíferos microsmáticos) es notablemente más simple que la de los roedores (mamíferos macrosmáticos). Además de todo lo anterior, nuestro estudio demuestra que las aferencias colinérgicas y noradrenérgicas que recibe el bulbo olfatorio del macaco, desde el telencéfalo basal y desde el locus coeruleus respectivamente, se mantienen conservadas filogenéticamente si las comparamos con los datos previos descritos en roedores. Por el contrario, esta conservación no se mantiene en el caso del sistema de modulación serotoninérgico que inerva al bulbo olfatorio desde el rafe. En este sentido, hemos hallado notables diferencias en cuanto al patrón de distribución de los axones que expresan serotonina cuando comparamos el bulbo olfatorio del macaco con el de la rata. En la rata, la capa más densamente inervada por los axones serotoninérgicos es la capa de los glomérulos olfatorios, mientras que en Macaca fascicularis es la capa de las células granulares. En la segunda parte de nuestro trabajo hemos realizado un estudio comparativo de los circuitos neuronales del bulbo olfatorio de macacos control y macacos parkinsonianos, con el objetivo de conocer si existen alteraciones en los animales parkinsonianos. Los principales resultados de esta parte se pueden resumir del siguiente modo. Los datos obtenidos nos permiten afirmar que, aunque se producen algunos cambios en su organización neuroanatómica y neuroquímica, los patrones de conectividad de la circuitería neuronal del bulbo olfatorio de los macacos no se encuentran alterados después del tratamiento con MPTP. Ya se ha demostrado en varios trabajos previos que el número de células periglomerulares dopaminérgicas experimenta un aumento significativo en el bulbo olfatorio de pacientes con Parkinson y de modelos animales de la enfermedad. Nuestro estudio corrobora este aumento. Y además, muestra, por primera vez, que el número de células periglomerulares que expresan nNOS, CB y CR no sufre ningún cambio estadísticamente significativo en los animales parkinsonianos. Cuando analizamos cuantitativamente la transmisión sináptica y los circuitos excitadores e inhibidores del bulbo olfatorio, sí encontramos algunas diferencias estadísticamente significativas al comparar los macacos parkinsonianos con sus controles. Concretamente, existe una disminución de la actividad sináptica en la capa de los glomérulos olfatorios y en la capa plexiforme externa tras el tratamiento con MPTP, tal y como hemos podido evaluar mediante la cuantificación de la densidad de puncta que expresan sinaptofisina. De igual modo, al analizar los circuitos excitadores, hallamos una reducción significativa en el número de puncta que expresan el transportador vesicular de glutamato 1 (VGLUT 1) en los macacos parkinsonianos. Por el contrario, al estudiar los circuitos inhibidores, no encontramos diferencias estadísticamente significativas cuando cuantificamos los elementos GABAérgicos del neuropilo que expresan la enzima ádico glutámico descarboxilasa (GAD). Además de las alteraciones que sufre el sistema dopaminérgico, algunos estudios previos al nuestro han demostrado que también existen alteraciones significativas en diferentes sistemas neuromoduladores durante el transcurso de la enfermedad de Parkinson. En este punto, cabe destacar que la inmensa mayoría de estos trabajos se centran en distintas regiones cerebrales, pero no analizan el bulbo olfatorio. Entre los sistemas neuromoduladores que se han visto afectados, tanto en enfermos de Parkinson como en modelos experimentales, se encuentran: el sistema colinérgico (se ha descrito degeneración del núcleo basal de Meynert, alteraciones en la corteza cerebral y reducción de los inputs colinérgicos del bulbo olfatorio), el serotoninérgico (se han visto alteraciones en el núcleo dorsal del rafe, núcleo caudado, corteza entorrinal, corteza cingulada, corteza frontal, tálamo o hipocampo) y el noradrenérgico (se han descrito severos daños en el locus coeruleus). En nuestro trabajo demostramos que la modulación subcortical que recibe el bulbo olfatorio de Macaca fascicularis no se ve alterada por el tratamiento con MPTP. Utilizando marcadores que nos permiten identificar y analizar las aferencias subcorticales colinérgicas, serotoninérgicas y noradrenérgicas, no hemos encontrado diferencias significativas ni en el patrón de distribución de las fibras marcadas, ni en el patrón de conectividad sináptica que presentan, ni en la densidad de elementos positivos que aparecen en el bulbo olfatorio de macacos parkinsonianos cuando los comparamos con sus controles. Por último, algunos trabajos previos al nuestro también se han encargado de estudiar posibles alteraciones de los procesos relacionados con la plasticidad y la neurogénesis adulta durante la enfermedad de Parkinson. Nosotros también hemos investigado este punto y hemos comparado la expresión de la forma polisializada de la molécula de adhesión celular neural (PSA-NCAM), un marcador de plasticidad, en el bulbo olfatorio de monos controles y parkinsonianos. Nuestros resultados confirman, al igual que otros datos previos, que en el bulbo olfatorio de macacos parkinsonianos existe una reducción de la plasticidad neuronal, puesto que el número de elementos del neuropilo que expresan PSA-NCAM se encuentra significativamente disminuido en estos animales. La presente Tesis Doctoral supone el primer estudio detallado de la organización neuroanatómica y de la conectividad de los circuitos neuronales que integran el bulbo olfatorio de Macaca fasciculis. Además, evalúa en qué medida se ven afectados esos circuitos en un modelo experimental de parkinsonismo inducido por la inyección sistémica de MPTP. Los datos que aporta nuestra investigación demuestran que el patrón general de conectividad de los circuitos neuronales del bulbo olfatorio de primates está conservado filogenéticamente cuando lo comparamos con el de la rata. Y además, no se ve alterado desde un punto de vista cualitativo tras el tratamiento con MPTP. Tampoco lo está el patrón de conectividad de los circuitos colinérgicos, serotoninérgicos y noradrenérgicos que modulan el procesamiento de la información olfatoria. Sin embargo, nuestros datos también demuestran que la conectividad sináptica de los circuitos neuronales del bulbo olfatorio sí que se ve afectada desde un punto de vista cuantitativo. Así lo revela la reducción significativa de la densidad de elementos del neuropilo que expresan sinaptofisina y transportador vesicular de glutamato en el bulbo olfatorio de los animales parkinsonianos. En la misma línea, a estas modificaciones provocadas por el tratamiento con MPTP, se suma la reducción significativa de la densidad de elementos del neuropilo que expresan marcadores de plasticidad neuronal. En conjunto, todas estas alteraciones podrían explicar, en mayor o menor medida, el déficit olfativo observado en la enfermedad de Parkinson.Parkinson disease is a neurodegenerative and multisystem disease which is pathologically characterized by a loss of dopaminergic neurons in the substantia nigra pars compacta (SNpc) and is also associated with inclusion bodies throughout the central and peripheral nervous system. These intraneuronal inclusion bodies, defined as Lewy neurites and Lewy bodies, constitute the hallmark of the neurodegenerative disease. Parkinson disease is clinically characterized by non-motor and motor symptoms, with the former preceding the latter by years -in some cases by twenty or even more years. Parkinson disease has long been considered by physicians as a purely motor disease, manifested by bradykinesia, rigidity, rest tremor, and postural instability. Nevertheless, more recently non-motor symptoms have been receiving increasing attention from physicians and scientists as useful biomarkers to diagnose the Parkinson disease in its early stages, even before any motor symptoms have appeared. The most prominent non-motor feature of Parkinson disease is probably hyposmia, or smell dysfunction, which appears in most cases (90%), and occurs frequently in preclinical stages of Parkinson disease. It is worth noting that this prevalence is higher than that of one of Parkinson disease’s cardinal symptoms, resting tremor, which appears in 75% of cases. Olfactory deficits in Parkinson disease are found in different levels of smell tasks such as identification of odour, detection of odour threshold, or odour recognition memory. This non-motor sign can be found in both idiopathic and familial Parkinson disease and is clearly linked to the first stages of the preclinical phase of Parkinson disease. Therefore, it is important to find out the possible causes for Parkinson disease-related olfactory dysfunction in order to understand the etiology and progress of this neurodegenerative disease. This is the reason why many efforts are being focused not only on the development of different kinds of olfactory tests, which allow to detect the hyposmia correctly, but also on the study of the olfactory brain of patients and animal models of Parkinson disease. Since the olfactory bulb is the region of the brain where the first relay of the olfactory information occurs, it is safe to think that the organization and the synaptic connectivity pattern of this area are somewhat altered during the Parkinson disease, and this might explain some of the causes of the olfactory dysfunction linked to early-estage Parkinson disease. The mechanisms underlying olfactory dysfunction in Parkinson disease are understudied and only partially understood. Only a few studies have focused their attention on revealing whether the olfactory pathway undergoes neuroanatomical alterations during the progress of Parkinson disease. Among them, some papers have described morphological alterations in the olfactory bulb of patients with Parkinson disease, such as the presence of ectopic glomeruli located in the external plexiform layer (Hoogland et al. 2003; Mundiñano et al. 2011) or the presence of Lewy bodies in mitral cells of the olfactory bulb (Úbeda-Bañón et al, 2010a). Recent studies have found an increased number of dopaminergic periglomerular cells in the olfactory bulb of Parkinson disease patients (Úbeda-Bañón et al, 2004; Carril-Mundiñano et al, 2011) and also in the olfactory bulb of some animal models of Parkinson disease, such as MPTP-treated monkeys (Belzunegui et al. 2007). While all these findings suggest that the organization of the bulbar circuitry is probably modified in pathological conditions, to date, there is not any detailed study about the organization and the connectivity of bulbar circuits of patients with Parkinson disease or experimental models of Parkinson disease. In this context, our study attempts to address such gap in the knowledge about Parkinson disease by investigating how the circuits of the olfactory bulb are affected in an experimental model of Parkinson disease - in particular, an MPTP-treated monkey. There are currently a wide variety of experimental models of Parkinson disease that can be used to study different aspects of the neurodegenerative disease. Among them, we have chosen a monkey model of Parkinson disease, in which the animals have been injected with a dopaminergic neurotoxine, 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP). Specifically, the macaque that has been used for

Cranial Pair I: The Olfactory Nerve

The olfactory nerve constitutes the first cranial pair. Compared with other cranial nerves, it depicts some atypical features. First, the olfactory nerve does not form a unique bundle. The olfactory axons join other axons and form several small bundles or fascicles: the fila olfactoria. These fascicles leave the nasal cavity, pass through the lamina cribrosa of the ethmoid bone and enter the brain. The whole of these fascicles is what is known as the olfactory nerve. Second, the olfactory sensory neurons, whose axons integrate the olfactory nerve, connect the nasal cavity and the brain without any relay. Third, the olfactory nerve is composed by unmyelinated axons. Fourth, the olfactory nerve contains neither Schwann cells nor oligodendrocytes wrapping its axons. But it contains olfactory ensheathing glia, which is a type of glia unique to this nerve. Fifth, the olfactory axons participate in the circuitry of certain spherical structures of neuropil that are unique in the brain: the olfactory glomeruli. Sixth, the axons of the olfactory nerve are continuously replaced and their connections in the central nervous system are remodeled continuously. Therefore, the olfactory nerve is subject to lifelong plasticity. Finally seventh, the olfactory nerve can be a gateway for the direct entrance of viruses, neurotoxins and other xenobiotics to the brain. In the same way, it can be used as a portal of entry to the brain for therapeutic substances, bypassing the blood-brain barrier. In this article, we analyze some features of the anatomy and physiology of the first cranial pair