Effects of availability of BMP-7 on osteoblastic cell cultures grown on a nanostructured titanium surface

A disponibilização de moléculas bioativas em superfícies de implantes metálicos osseointegráveis objetiva promover a formação óssea na região interfacial durante o processo de reparo, especialmente em sítios anatômicos com baixa densidade óssea. Entre os diferentes aspectos físico-químicos de superfícies de titânio (Ti), a nanotopografia obtida por H2SO4 e H2O2 (Nano-Ti) constitui-se em opção importante para esta finalidade, pelos benefícios que proporciona à formação óssea. Apesar de a proteína óssea morfogenética 7 (BMP-7) ser reconhecida como estimuladora da diferenciação osteoblástica, são ainda contraditórios os efeitos de sua disponibilização sobre a aquisição do fenótipo osteogênico em contato com Ti. Os objetivos deste trabalho foram avaliar os efeitos 1) da suplementação de BMP-7 ao meio de cultura sobre parâmetros chaves de sinalização/diferenciação celulares durante a fase proliferativa de culturas de células pré-osteoblásticas MC3T3-E1 e UMR-106 crescidas sobre Ti Controle e Nano-Ti (Estudo 1), e 2) da funcionalização de BMP-7 em Nano-Ti sobre a sinalização/diferenciação de células MC3T3-E1 crescidas em contato com coágulo sanguíneo ex vivo, formado previamente por implantação subcutânea de Nano-Ti em camundongos (Estudo 2). No Estudo 1, células MC3T3-E1 sobre Ti Controle e Nano-Ti apresentaram responsividades distintas à BMP-7 a 40 ng/mL e 200 ng/mL. Enquanto que efeitos osteogênicos significativos foram observados sobre Ti Controle em relação à proliferação celular, expressão de Runx2, Osx, Alp, Bsp, Opn, Smad 1 e atividade de ALP in situ, sobre Nano-Ti esses efeitos se limitavam ao aumento da expressão de Alp, Bsp, Opn e atividade de ALP in situ, majoritariamente já com 40 ng/mL de BMP-7. Essa concentração mantinha inalterado o potencial osteogênico de culturas UMR-106, enquanto que a de 200 ng/mL o reduzia. No Estudo 2, a presença do coágulo sanguíneo sobre Nano-Ti inibiu a expressão de marcadores osteoblásticos em células MC3T3-E1, com exceção para Opn, mantendo inalteradas as de Smad 1 e Smad 4. A funcionalização com BMP-7, por simples adsorção de solução a 400 ng/mL, resultou em tendência à maior diferenciação osteoblástica sobre o coágulo sanguíneo, mas em menor grau em comparação ao de culturas crescidas diretamente sobre Nano-Ti, o que foi corroborado pela quantificação de RUNX2, sem, no entanto, alterar a expressão das Smads avaliadas. Quantidades menores de OPN, SMAD 1, 5 e 9 fosforilada e SMAD 4 foram detectadas em culturas expostas à BMP-7, com exceção para OPN naquelas crescidas diretamente sobre Nano-Ti. A forma clivada de OPN e bandas de menor peso molecular reconhecidas pelos anticorpos anti-SMAD 1, 5 e 9 fosforilada e anti-SMAD 4 foram observadas apenas na presença de coágulo sanguíneo. Em conclusão, a disponibilização de BMP-7 para células MC3T3-E1 nas concentrações de 40 ng/mL e 200 ng/mL altera o perfil de expressão de marcadores osteoblásticos, indicativo da aquisição de um estágio mais avançado de diferenciação celular, com efeitos mais pronunciados para Ti Controle, entretanto sem refletir em aumento da produção de matriz mineralizada por células UMR-106. A presença de coágulo sanguíneo ex vivo sobre Nano-Ti reduz a diferenciação de células MC3T3-E1, com tendência à reversão para o estímulo à diferenciação osteoblástica com a funcionalização de BMP-7.The availability of bioactive molecules on osseointegrable, metallic implant surfaces aims at promoting bone formation in the interfacial area during tissue repair, mainly at anatomic sites with low bone density. Among the diverse physico-chemical features of titanium (Ti) surfaces, the nanotopography created by treatment with H2SO4 and H2O2 (Nano-Ti) can be a good candidate for that purpose, as it positively impacts bone formation. Although the bone morphogenetic protein 7 (BMP-7) has been shown to be stimulatory for osteoblastic differentiation, the effects of its availability on the acquisition of the osteogenic phenotype on Ti are still contradictory. The present study aimed at evaluating 1) the effects of supplementation of the culture medium with BMP-7 on key parameters of cell signalling/differentiation during the proliferative phase of preosteoblastic MC3T3-E1 and UMR-106 cell cultures grown on Control Ti and Nano-Ti (Study 1), and 2) the effects of BMP-7 functionalization on key parameters of cell signalling/differentiation of pre-osteoblastic MC3T3-E1 cell cultures grown in contact with ex vivo blood clot that was previously formed on Nano-Ti by means of subcutaneous implantation in mice (Study 2). The results of the Study 1 showed that MC3T3-E1 cells grown either on Control Ti or Nano-Ti exhibited distinct responsiveness to 40 ng/mL and 200 ng/mL BMP-7. Already with the lower concentration of BMP-7, significant osteogenic effects were noticed for Control Ti group in terms of cell proliferation, Runx2, Osx, Alp, Bsp, Opn, and Smad 1 mRNA expression and in situ ALP activity, while for Nano-Ti these were limited to higher Alp, Bsp, and Opn mRNA expression and in situ ALP activity. The osteogenic potential of UMR-106 cultures was maintained inaltered with 40 ng/mL BMP-7 and was reduced when cells were exposed to the 200 ng/mL concentration. The results of the Study 2 showed that the presence of bood clot inhibited the expression of the osteoblast markers by MC3T3-E1 cells, except for Opn, while unaffecting those of Smad 1 and Smad 4. The surface functionalization of Nano-Ti, by simple adsorption using a solution of 400 ng/mL BMP-7, resulted in a tendence towards higher osteoblastic cell differentiation on blood clot, but in a lesser degree compared with that of the cultures grown directly on Nano-Ti- a finding that was corroborated by the quantification of RUNX2, while unaffecting the expression of Smads 1 and 4. Smaller quantities of OPN, phosphorylated SMAD 1, 5 and 9, and SMAD 4 were detected in cultures exposed to BMP-7, except for OPN in those grown directly on Nano-Ti. The cleaved form of OPN and bands with lower molecular weight recognized by the antibodies against phosphorylated SMAD 1, 5 and 9 and SMAD 4 were observed only in the presence of blood clot. In conclusion, the availability of BMP-7 to MC3T3-E1 cells at the concentrations used alters the expression profile of osteoblast markers, indicative of the acquisition of a more advanced stage of differentiation, more pronounced for Control Ti, but without reflecting in higher mineralized matrix production by UMR-106 cultures. The presence of an ex vivo blood clot on Nano-Ti reduces the differentiation of MC3T3-E1 cells, with a tendency to reversion towards osteoblastic differentiation with BMP-7 functionalization

Salivary, blood and plasma concentrations of nitric oxide in patients with periodontal disease before and after non-surgical periodontal treatment

O Óxido Nítrico (NO) faz parte de uma família de radicais livres que está envolvida em várias funções do organismo como controle cardiovascular, homeostase, formação óssea, neurotransmissão e funções imunológicas. Tem sido descrito que o NO atuaria na resposta de defesa do hospedeiro frente à infecção dos tecidos orais. Por outro lado, tem sido descrito também que quantidades excessivas de NO podem contribuir para a destruição tecidual na periodontite. Além destes aspectos muito importantes na boca, o NO é uma das moléculas de maior importância para a saúde humana, pois a sua liberação pelo endotélio dos vasos é um componente fundamental para o controle da pressão arterial. Já foi demonstrado que bactérias comensais da boca seriam responsáveis pela produção de nitritos que, no estômago, seriam convertidos a NO e este absorvido. Como as quantidades de nitrito na saliva são cerca de mil vezes maiores do que aquelas detectadas no sangue total, acredita-se que o nitrito da saliva possa ter repercussão no NO do sangue total e possivelmente possa também ter algum efeito na regulação de eventos sistêmicos, como a própria pressão arterial. O número de trabalhos sobre NO na saliva encontrados na literatura científica de língua inglesa não soma 2 dezenas, e pela importância do assunto, faz-se necessário conhecer em detalhes as concentrações de nitrito nos diferentes tipos de saliva, no sangue total, eritrócitos e plasma em pacientes com doença periodontal e controles, antes e depois do tratamento. As hipóteses deste estudo são: 1- Que as concentrações de nitrito sejam menores na saliva total de indivíduos com doença periodontal e que estas aumentem após o tratamento periodontal; 2- Que haveria o mesmo perfil de variação nas concentrações de nitrito no sangue total, eritróticos e plasma vista na saliva total. No presente estudo avaliaram-se as concentrações de NO na saliva total, saliva sumandibular/sublingual, parotídea, no sangue total, eritrócitos e plasma de pacientes controle e pacientes com doença periodontal crônica, com coletas antes e 3 meses após o tratamento periodontal não cirúrgico. A seguir testou-se se eram significativas as diferenças entre os valores obtidos antes e após o tratamento e foram comparados os perfis dos resultados de nitrito na saliva e sangue total. Foram realizadas as dosagens de NO pelo método de análise de quimiluminescência. Os resultados obtidos mostraram que em todos os parâmetros clínicos houve diferença estatisticamente significante antes e após o tratamento periodontal (DPA e DPD), nos grupos controle antes e depois do tratamento (CA e CD) e nos controles antes e doentes antes do tratamento (CA e DPA).Sangramento a sondagem: (DPA versus DPD) p<0,0001, (CA versus CD) p=0,0005 , (CA versus DPA) p<0,0001. Nivel clinico de inserção: (DPA versus DPD) p<0,0001, (CA versus CD) p=0,01 , (CA versus DPA) p<0,0002. Profundidade de sondagem: (DPA versus DPD) p<0,0001, (CA versus DPA) p<0,0001. Sítios maiores que 4 mm: (DPA versus DPD) p<0,0001, (CA versus DPA) p<0,0001. Tal fato confirma um tratamento periodontal realizado com sucesso. Na saliva total, houve significante diminuição das concentrações de NO entre os controles antes e os doentes antes do tratamento (CA versus PDA), com p= 0,04. No sangue total houve diminuição das concentrações de NO antes e após o tratamento periodontal (DPA versus DPD), p=0,026. Já nos eritrócitos antes e após o tratamento (DPA versus DPD) houve significante diminuição, p=0,02. As concentrações de nitrito na saliva total tiveram medianas igual a 0,69 (Q1: 0,46/ Q3: 1,44) no grupo CA, mediana de 0,55 (Q1: 0,39/ Q3: 1,55) no grupo CD, mediana de 0,44 (Q1: 0,26/ Q3: 0,81) no grupo DPA e mediana de 0,38 (Q1: 0,22/ Q3: 0,69) no grupo DPD. As concentrações de nitrito na saliva submandibular/sublingual tiveram medianas igual a 1,86 (Q1: 0,61/ Q3: 4,59) no grupo CA, mediana de 0,64 (Q1: 1,82/ Q3: 4,37) no grupo CD, mediana de 2,37 (Q1: 0,47/ Q3: 4,79) no grupo DPA e mediana de 2,69 (Q1: 1,69/ Q3: 3,43) no grupo DPD. As concentrações de nitrito na saliva parotídea apresentaram médias de 0,58, e desvio padrão de 0,32 no grupo CA, média de 0,69 e desvio padrão de 0,33 no grupo CD, média de 0,69 e desvio padrão de 0,36 no grupo DPA e média de 0,85 e desvio padrão de 0,58 no grupo DPD. As concentrações de nitrito no sangue total tiveram medianas igual a 1,41 (Q1: 1,1/ Q3: 2,21) no grupo CA, mediana de 0,99 (Q1: 0,58/ Q3: 2,11) no grupo CD, mediana de 1,61 (Q1: 1,12/ Q3: 2,3) no grupo DPA e mediana de 1,45 (Q1: 0,61/ Q3: 0,87) no grupo DPD. As concentrações de nitrito nos plasma tiveram medianas igual a 0,51 (Q1: 0,36/ Q3: 1,09) no grupo CA, mediana de 0,63 (Q1: 0,56/ Q3: 1,82) no grupo CD, mediana de 0,60 (Q1: 0,37/ Q3: 0,97) no grupo DPA e mediana de 0,5 (Q1: 0,39/ Q3: 0,83) no grupo DPD. As concentrações de nitrito no eritrócitos apresentaram médias de 0,45 e desvio padrão de 0,41 no grupo CA, média de 0,46 e desvio padrão de 0,47 no grupo CD, média de 0,57 e desvio padrão de 0,44 no grupo DPA e média de 0,29 e desvio padrão de 0,22 no grupo DPD. As concentrações de nitrito foram da ordem de micromolar na saliva e de nanomolar no sangue total, guardando uma relação de cerca de 1000 vezes entre estes 2 fluidos. As concentrações de nitrito obtidas foram decrescentes na seguinte ordem: saliva total, saliva sumandibular/sublingual, saliva parotídea, eritrócitos sangue total e plasma. Na saliva, os pacientes do grupo DPA e DPD apresentaram concentrações menores de nitrito em relação ao CA e CD (p<0.05), e o tratamento periodontal não teve efeito sobre as concentrações de nitrito. Também houve diminuição estatisticamente significante nas concentrações de nitrito no sangue total e eritrócitos após o tratamento periodontal (DPA versus DPD). Os resultados sugerem que não há relação entre as concentrações salivares e sanguíneas de nitrito. As concentrações salivares diminuídos depois do tratamento em pacientes com doença periodontal podem talvez estar associados com aumento dos níveis de arginase. Além disso, aumento nas concentrações sanguíneas de nitrito parecem estar associados aos aumentos de mediadores inflamatórios como IL-6, proteina C reativa, entre outros. As concentrações de nitrito no sangue total sugerem que a diminuição após o tratamento possa ser resultado da diminuição na atividade inflamatória nos pacientes com doença periodontal, já caracterizada anteriormente neste grupo de pacientes.The Nitric Oxide (NO) is part of a family of free radicals that are involved in various bodily functions such as cardiovascular control, homeostasis, bone formation, neurotransmission and immune functions. It has been reported that NO act in response to host defense against infection of the oral tissues. Moreover, it has also been described that excessive amounts of NO can contribute to the periodontal tissue destruction. In addition to these very important aspects in the mouth, NO is a molecule of major importance to human health, since its release by the endothelium of blood vessels is a critical component to blood pressure control. It has been demonstrated that commensal bacteria of the mouth would be responsible for production of nitrites, in the stomach, be converted to NO and this be absorbed. The amount of nitrite in the saliva is about one thousand times greater than those detected in whole blood, it is believed that the nitrite saliva may have the effect of whole blood and NO can also possibly have an effect on regulation of systemic events as the proper blood pressure. The number of papers on NO in the saliva found in the literature of the English language does not add 2 tens, and the importance of the subject, it is necessary to know in detail the concentrations of nitrite in different types of saliva, whole blood, erythrocytes and plasma in patients with periodontal disease and controls before and after treatment. The hypotheses of this study are: 1 - That the nitrite concentrations are lower in whole saliva of individuals with periodontal disease and that they increase after periodontal treatment, 2 - What there would be the same profile of variation in the concentrations of nitrite in blood, erythrocytes and plasma seen in the whole saliva. In the present study were evaluated the concentrations of NO in whole saliva, salivasumandibular / sublingual, parotid, whole blood, erythrocytes and plasma of control patients and patients with chronic periodontits, with collections before and three months after non-surgical periodontal treatment. The following were tested if significant differences between the values obtained before and after treatment were compared and the profiles of the the results of nitrite in the saliva and blood. Were performed measurements of NO by Chemiluminescence analysis method. The results showed that in all clinical parameters were statistically significant differences before and after periodontal treatment (DPA and DPD) in the control groups before and after treatment (CA and CD) and controls before and patients before treatment (CA and DPA). Bleeding on Probe (DPA versus DPD) p<0,0001, (CA versus CD) p=0,0005, (CA versus DPA) p<0,0001. Clinical attachment level: (DPA versus DPD) p<0,0001, (CA versus CD) p=0,01 , (CA versus DPA) p<0,0002. Probing depth: (DPA versus DPD) p<0,0001, (CA versus DPA) p<0,0001. Sites larger than 4 mm: (DPA versus DPD) p<0,0001, (CA versus DPA) p<0,0001. This fact confirms a periodontal treatment performed successfully. In whole saliva, a significant decrease in NO concentration between controls and patients before treatment (CA versus PDA), with p = 0.04. Whole blood decreased NO concentration before and after periodontal treatment (DPA versus DPD), p = 0.026. Already in erythrocytes before and after treatment (DPA versus DPD) there was a significant decrease, p = 0.02. The concentrations of nitrite in whole saliva had median equal to 0.69 (Q1: 0.46 / Q3:1.44) in group CA, a median of 0.55 (Q1: 0.39 / Q3: 1.55) in CD group, median 0.44 (Q1: 0.26 / Q3: 0.81) in the DPA and a median of 0.38 (Q1: 0.22 / Q3: 0.69) in the DPD. The concentrations of nitrite in saliva submandibular / sublingual medians were equal to 1.86 (Q1: 0.61 / Q3: 4.59) in group CA, a median of 0.64 (Q1: 1.82 / Q3: 4.37 ) in the CD and a median of 2.37 (Q1: 0.47 / Q3: 4.79) in the DPA and a median of 2.69 (Q1: 1.69 / Q3: 3.43) in the DPD. The nitrite concentrations in parotid saliva showed mean of 0.58 and standard desviation of 0.32 in the CA group, mean 0.69 and standard deviation of 0.33 in CD group, mean 0.69 and standard deviation of DPA and 0.36 in the group average of 0.85 and standard deviation of 0.58 in the DPD group. The concentrations of nitrite in whole blood were median equal to 1.41 (Q1: 1.1 / Q3: 2.21) in group CA, a median of 0.99 (Q1: 0.58 / Q3: 2.11) in CD group, median 1.61 (Q1: 1.12 / Q3: 2.3) in the DPA and a median of 1.45 (Q1: 0.61 / Q3: 0.87) in the DPD. The plasma concentrations of nitrite in the medians were equal to 0.51 (Q1: 0.36 / Q3: 1.09) in group CA, a median of 0.63 (Q1: 0.56 / Q3: 1.82) in group CD and a median of 0.60 (Q1: 0.37 / Q3: 0.97) in the DPA and a median of 0.5 (Q1: 0.39 / Q3: 0.83) in the DPD. The concentrations of nitrite in erythrocytes showed averages of 0.45 and standard deviation of 0.41 in the CA group, mean 0.46 and standard deviation of 0.47 in the CD group, mean 0.57 and standard deviation of 0, 44 DPA and the group average of 0.29 and standard deviation of 0.22 in DPD group. The nitrite concentrations were in the order of micromolar and nanomolar saliva in whole blood, keeping a ratio of about 1000-fold between the two fluids. The concentrations of nitrite were obtained in the following descending order: whole saliva, saliva submandibular / sublingual, parotid saliva, whole blood, erythrocytes and plasma. In saliva, the patients in the PDA and DPD showed lower concentrations of nitrite in relation to CA and CD (p <0.05), and periodontal treatment had no effect on concentrations of nitrite. There was also a statistically significant decrease in nitrite concentrations in whole blood and erythrocytes after periodontal treatment (DPA versus DPD). The results suggest that there is no relationship between the salivary and blood concentrations of nitrite. Salivary levels decreased after treatment in patients with periodontal disease may perhaps be associated with increased levels of arginase. Furthermore, increased blood concentration of nitrite may be associated with increases in inflammatory mediators such as IL-6, C-reactive protein, among others. The nitrite concentrations in whole blood suggest that reduced after treatment may be a consequence of diminished inflammatory activity in patients with periodontal disease, characterized already earlier in this group of patients

Aging behavior of Y-TZP with bioglass addition and its impact on the flexural strength and osteoblastic cell response

Y-TZP containing Ca2P2O7 are promising bioceramics with potential applications in dental implants and dentistry. These ceramics were developed by the introduction of a refractory sol-gel derived CaO-P2O5-SiO2 bioglass into Y-TZP; Ca2P2O7, and ZrSiO4 phases were formed in situ after sintering. The aging process of Y-TZP with different glass additions was studied. The effect of glass addition on the flexural strength and osteoblastic cell response of non-aged and aged Y-TZP was investigated. Y-TZP exhibited the most pronounced tetragonal (t) to monoclinic (m) transformation of zirconia (ZrO2) during aging; the addition of glass contents between 5 and 20 vol% improved the aging resistant of Y-TZP. Y-TZP flexural strength markedly decreased with increasing aging time; in contrast, the ceramics with glass did not alter their flexural strength upon aging. An increase in the Ca2P2O7 content with increasing glass up to 10 vol%, promoted both the cell viability and the osteogenic differentiation of UMR-106 cells on non-aged and aged samples. The high micro-roughness of Y-TZP with 20 vol% glass after aging, limited the proliferation and the osteogenic potential of the cultures. Y-TZP with 10 vol% glass had the best combination of properties in terms of flexural strength and osteoblast cell response.Fil: Soubelet, Clara Gabriela. Provincia de Buenos Aires. Gobernación. Comisión de Investigaciones Científicas. Centro de Tecnología de Recursos Minerales y Cerámica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Centro de Tecnología de Recursos Minerales y Cerámica; ArgentinaFil: Albano, Maria Patricia. Provincia de Buenos Aires. Gobernación. Comisión de Investigaciones Científicas. Centro de Tecnología de Recursos Minerales y Cerámica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Centro de Tecnología de Recursos Minerales y Cerámica; ArgentinaFil: Zuardi, Leonardo Raphael. Universidade de Sao Paulo; BrasilFil: Secco Martorano, Antonio. Universidade de Ribeirão Preto; BrasilFil: de Castro Raucci, Larissa Moreira Spinola. Universidade de Ribeirão Preto; BrasilFil: Oliveira, PauloTambasco de. Universidade de Sao Paulo; Brasi

Effects of rmBMP-7 on Osteoblastic Cells Grown on a Nanostructured Titanium Surface

This study evaluates the effects of the availability of exogenous BMP-7 on osteoblastic cells’ differentiation on a nanotextured Ti surface obtained by chemical etching (Nano-Ti). The MC3T3-E1 and UMR-106 osteoblastic cell lines were cultured for 5 and 7 days, respectively, on a Nano-Ti surface and on a control surface (Control-Ti) in an osteogenic medium supplemented with either 40 or 200 ng/mL recombinant mouse (rm) BMP-7. The results showed that MC3T3-E1 cells exhibited distinct responsiveness when exposed to each of the two rmBMP-7 concentrations, irrespective of the surface. Even with 40 ng/mL rmBMP-7, important osteogenic effects were noticed for Control-Ti in terms of cell proliferation potential; Runx2, Osx, Alp, Bsp, Opn, and Smad1 mRNA expression; and in situ ALP activity. For Nano-Ti, the effects were limited to higher Alp, Bsp, and Opn mRNA expression and in situ ALP activity. On both surfaces, the osteogenic potential of UMR-106 cultures remained unaltered with 40 ng/mL rmBMP-7, but it was significantly reduced when the cultures were exposed to the 200 ng/mL concentration. The availability of rmBMP-7 to pre-osteoblastic cells at the concentrations used alters the expression profile of osteoblast markers, indicative of the acquisition of a more advanced stage of osteoblastic differentiation. This occurs less pronouncedly on the nanotextured Ti and without reflecting in higher mineralized matrix production by differentiated osteoblasts on both surfaces