Transition SAMS/SAMR chez les patients atteints de mucoviscidose suivis au CHU de Rouen (dynamique de colonisation et lien avec les cures antibiotiques)

La mucoviscidose est une pathologie complexe, notamment sur le plan des infections respiratoires, qui occupent une place importante dans la gravité de la maladie. Bien que Staphylococcus aureus soit une des plus fréquentes bactéries retrouvée chez ces patients, son rôle dans le déclin de la fonction respiratoire reste controversé, et les caractéristiques de la colonisation par cette bactérie encore peu connues.Ce travail a consisté à décrire la dynamique de colonisation par Staphylococcus aureus des patients atteints de mucoviscidose suivis au CHU de Rouen, plus particulièrement au moment de la transition SAMS/SAMR, ainsi que d étudier les circonstances de survenue des SAMR chez ces patients. Cette description comprend l étude des caractéristiques phénotypiques et génotypiques par spa-typing des Staphylococcus aureus, ainsi que l analyse des antibiothérapies administrées avant et après l émergence du SAMR. Une persistance d une même souche de SAMS a été majoritairement retrouvée, avec la présence fréquente de co-colonisation SAMS/SAMR, ainsi que d une diversité phénotypique de variants d une même souche. L émergence de SAMR chez ces patients est principalement due à l acquisition d une nouvelle souche, qui a tendance à persister, et est précédée d une antibiothérapie potentiellement sélectionnante dans seulement deux tiers des cas. Enfin, le SAMR est presque toujours pris en compte dans le traitement antibiotique mais n est que partiellement éradiqué.ROUEN-BU Médecine-Pharmacie (765402102) / SudocSudocFranceF

Apport phylogénétique du polymorphisme de gènes domestiques et de gènes associés à la virulence chez Clostridium difficile

L'objectif principal de notre travail était d'étudier l'apport phylogénétique du polymorphisme de gènes domestiques et de gènes associés à la virulence chez Clostridium difficile. Nous avons tout d'abord développé un schéma de MultiLocus Sequence Typing (MLST) pour explorer la structure de population et le mode d'évolution génomique de cette espèce. L'analyse du polymorphisme de sept gènes domestiques par MLST a permis de mettre en évidence le caractère clonal marqué de C. difficile. Ce travail suggère l'absence de lignée particulièrement associée à un contexte clinique se vère (colite pseudomembraneuse), et d'absence de spécififcité d'hôte. Un clone très homogène réunit toutes les souches dites "variantes A-B+" , et suggère que ce clone a une origine phylogénétique récente. Nous avons dans un second temps développé une analyse multilocus du polymorphisme de gènes associés à la virulence. Nous avons pu confirmer le caractère clonal de C. difficile et l'originalité phylogénétique des souches A-B+. Le polymorphisme de ces gènes associés à la virulence ne semble pas lié à des différences de virulence ni au contexte clinique d'isolement des souches. Ce travail suggère une co-évolution de plusieurs gènes de virulence analysés (dont les gènes de toxines) et des gènes domestiques, alors que quatre gènes (slpA, cwp66, fliC et fliD) semblent être le siège de recombinaisons génétiques et être soumis à une pression de sélection environnementale. Un autre aspect de ce travail a été d'exploiter l'un des gènes domestiques analysés par MLST, le gène tpi, codant une triosephosphate isomérase, à des fins diagnostiques et taxonomiques. Son degré de conservation chez C. difficile, et son polymorphisme interspecifique en font un marqueur spécifique d'espèce, que nous avons d'abord inclus dans un schéma de PCR multiplex permettant simultanément une identififcation des souches et la caratérisation de leur profil toxinique par les gènes tcdB (toxine B) et tcdA (toxine A). Ensuite, nous avons exploité l'intérêt taxonomique et phylogénétique du polymorphisme du gène tpi de façon plus large, au sein du genre Clostridium. Comparativement à l'ADNr 16S le gène tpi s'avère être un marqueur moléculaire taxonomique et phylogénétique alternatif, présentant l'avantage d'un pouvoir discriminant supérieur.ROUEN-BU Médecine-Pharmacie (765402102) / SudocSudocFranceF

Caractérisation de la résistance aux bétalactamines des isolats de P. aeruginosa chez les patients atteints de mucoviscidose suivis au CRCM de Rouen

P. aeruginosa est un pathogène opportuniste, volontiers nosocomial chez les sujets sains, reconnu responsable, dans le cadre de la mucoviscidose, de la dégradation de la fonction respiratoire et de l'aggravation de l'affection. Le travail rétrospectif rapporté ici s'appuie sur 42 prélèvements provenant de 25 patients suivis au CRCM de Rouen. Le principal objectif de ce travail était d'étudier la prévalence des mécanismes de résistance aux bétalactamines pour ces malades atteints de mucoviscidose. Cette étude souligne, grâce la réalisation d'antibiogrammes ainsi que par génotypage par ERIC PCR, que le nombre élevé de morphotypes différents par patient n'était en fait que la diversification à partir d'une seule souche ancestrale de différentes sous populations génétiquement identiques. Nous avons également pu montrer à l'aide de ces arguments moléculaires qu'il n'existe a priori pas de transmission croisée de souches de P. aeruginosa au sein du CRCM. Différentes investigations, tant phénotypiques que moléculaires nous ont également permis de montrer que le seul mécanisme retrouvé responsable de la multirésistance de ces souches est l'hyperproduction de céphalosporinase, aucune BLSE, pénicillinases, ni métallo bétalactamases n'ayant pu être objectivées. Enfin, l'exploitation des résultats laisse penser que l'acquisition de résistances par mutations est prépondérante par rapport à l'acquisition de matériel génétique étranger.ROUEN-BU Médecine-Pharmacie (765402102) / SudocSudocFranceF

Intérêts phylogénétique et diagnostique du polymorphisme de gènes domestiques chez Clostridium difficile

C. difficile est une bactérie entéropathogène volontiers nosocomiale reconnue responsable, dans un contexte d'antibiothérapie, de nombreuses diarrhées et de la majorité des colites pseudomembraneuses. Le travail de phylogénie moléculaire, rapporté ici, a permis de montrer un degré de clonalité très élevé chez cette espèce. Nous avons pu montrer également que l'étude du polymorphisme de gènes domestiques par MLST était tout à fait adaptée à l'étude de la structure de population de C. difficile et de son mode d'évolution génomique. Ce travail souligne par ailleurs l'existence d'une sous-population homogène de souches de profil toxinique A-B+, potentiellement pathogènes, dont l'origine phylogénétique reste cependant à préciser. Sur le plan diagnostique, nous avons pu construire une PCR multiplex ciblant l'un des gènes domestiques caractérisés préalablement par MLST (tpi), ainsi que les gènes tcdA et tcdB. Cette PCR permet la caractérisation directe du profil toxinique des souches dès leur détection.ROUEN-BU Médecine-Pharmacie (765402102) / SudocSudocFranceF

Multilocus Sequence Typing Analysis of Human and Animal Clostridium difficile Isolates of Various Toxigenic Types

A multilocus sequence typing (MLST) scheme was developed to study the genetic relationships and population structure of 72 Clostridium difficile isolates from various hosts, geographic sources, PCR ribotypes, and toxigenic types (determined by PCR targeting tcdA and tcdB genes). MLST was performed by DNA sequence analysis of seven housekeeping genes (aroE, ddl, dutA, tpi, recA, gmk, and sodA). The number of alleles ranged from five (dutA and ddl) to eleven (recA). Allelic profiles allowed the definition of 34 different sequence types (STs). These STs lacked correlation with geographic source but were well correlated to toxigenic type. The dendrogram generated from a matrix of pairwise genetic distances showed that animal isolates did not constitute a distinct lineage from human isolates and that there was no hypervirulent lineage within the population of toxigenic human isolates (isolates recovered from pseudomembranous colitis and antibiotic-associated diarrhea did not cluster in distinct lineages). However, A(−) B(+) variant isolates shared the same ST that appeared as a divergent lineage in the population studied, indicating a single evolutionary origin. The population structure was further examined by analysis of allelic polymorphism. The dendrogram generated from composite sequence-based analysis revealed a homogeneous population associated with three divergent lineages, one of which was restricted to A(−) B(+) variant isolates. C. difficile exhibited a clonal population structure, as revealed by the estimation of linkage disequilibrium (Ia) between loci. The analysis of alleles within clonal complexes estimated that point mutation generated new alleles at a frequency eightfold higher than recombinational exchange, and the congruence of the dendrograms generated from separate housekeeping loci confirmed the mutational evolution of this species

Direct antimicrobial susceptibility testing method for analysis of sputum collected from patients with cystic fibrosis

AbstractBackgroundChronic Pseudomonas aeruginosa colonisation and subsequent exacerbations in patients with cystic fibrosis (CF) require antimicrobial treatment. But since multiple morphotypes and other Gram-negative bacteria with different antibiotic susceptibilities are often isolated inside the same sputum sample, bacteriological analysis is difficult.MethodsTo simplify this analysis, we explored a direct sputum antimicrobial susceptibility testing (DSST) method by applying E test directly on plates inoculated with the sputum. A total of 316 samples collected from CF patients were analysed and compared with standard procedures (SP) for the identification and antimicrobial susceptibility testing of all Gram-negative bacterial species.ResultsDSST was as efficient as SP to detect P. aeruginosa including the mucoid morphotype in monomicrobial specimen, but was less sensible to detect all Gram-negative bacteria present in the same sample. It allowed the direct reading of the MIC inhibiting all Gram-negative bacteria. Agreements between these global MICs with the cumulative antibiotics susceptibility of all Gram-negative bacteria measured by SP were excellent for tobramycin and imipenem (>96%) and satisfactory for ticarcillin, ceftazidime, aztreonam and ciprofloxacin (90.4% to 94.3%).In conclusion, the DSST method is an efficient and easy antibiotic susceptibility testing method

Genomic and expression analysis of the vanG-like gene cluster of Clostridium difficile

Primary antibiotic treatment of Clostridium difficile intestinal diseases requires metronidazole or vancomycin therapy. A cluster of genes homologous to enterococcal glycopeptides resistance vanG genes was found in the genome of C. difficile 630, although this strain remains sensitive to vancomycin. This vanG-like gene cluster was found to consist of five ORFs: the regulatory region consisting of vanR and vanS and the effector region consisting of vanG, vanXY and vanT. We found that 57 out of 83 C. difficile strains, representative of the main lineages of the species, harbour this vanG-like cluster. The cluster is expressed as an operon and, when present, is found at the same genomic location in all strains. The vanG, vanXY and vanT homologues in C. difficile 630 are co-transcribed and expressed to a low level throughout the growth phases in the absence of vancomycin. Conversely, the expression of these genes is strongly induced in the presence of subinhibitory concentrations of vancomycin, indicating that the vanG-like operon is functional at the transcriptional level in C. difficile. Hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC-HPLC) and MS analysis of cytoplasmic peptidoglycan precursors of C. difficile 630 grown without vancomycin revealed the exclusive presence of a UDP-MurNAc-pentapeptide with an alanine at the C terminus. UDP-MurNAc-pentapeptide [D-Ala] was also the only peptidoglycan precursor detected in C. difficile grown in the presence of vancomycin, corroborating the lack of vancomycin resistance. Peptidoglycan structures of a vanG-like mutant strain and of a strain lacking the vanG-like cluster did not differ from the C. difficile 630 strain, indicating that the van G-like cluster also has no impact on cell-wall composition

Clostridium difficile Has an Original Peptidoglycan Structure with a High Level of N-Acetylglucosamine Deacetylation and Mainly 3-3 Cross-links

The structure of the vegetative cell wall peptidoglycan of Clostridium difficile was determined by analysis of its constituent muropeptides with a combination of reverse-phase high pressure liquid chromatography separation of muropeptides, amino acid analysis, mass spectrometry and tandem mass spectrometry. The structures assigned to 36 muropeptides evidenced several original features in C. difficile vegetative cell peptidoglycan. First, it is characterized by a strikingly high level of N-acetylglucosamine deacetylation. In addition, the majority of dimers (around 75%) contains A(2)pm(3) -> A(2)pm(3) (A(2)pm, 2,6-diaminopimelic acid) cross-links and only a minority of the more classical Ala(4) -> A(2)pm(3) cross-links. Moreover, a significant amount of muropeptides contains a modified tetrapeptide stem ending in Gly instead of D-Ala(4). Two L,D-transpeptidases homologues encoding genes present in the genome of C. difficile 630 and named ldt(cd1) and ldt(cd2), were inactivated. The inactivation of either ldt(cd1) or ldt(cd2) significantly decreased the abundance of 3-3 cross-links, leading to a marked decrease of peptidoglycan reticulation and demonstrating that both ldt(cd1)-and ldt(cd2)-encoded proteins have a redundant L, D-transpeptidase activity. The contribution of 3-3 cross-links to peptidoglycan synthesis increased in the presence of ampicillin, indicating that this drug does not inhibit the L,D-transpeptidation pathway in C. difficile