Facteurs d'hôtes influençant la sécrétion de protéines hétérologues chez Lactococcus lactis

Les bactéries lactiques présentent une parfaite innocuité hygiénique et sont de bons candidats pour le développement de nouvelles utilisations. Dans le développement de vaccins vivants, la sécrétion peut être préférable à une production cytoplasmique. Nous avons étudié la sécrétion de protéines hétérologues chez Lactococcus lactis en employant la nucléase de S. aureus comme protéine sécrétée modèle. Nous avons agi sur les facteurs intrinsèques de Nuc par l'utilisation d'un peptide signal de L. lactis pour diriger la sécrétion et sur l'équilibre des charges de la partie N-terminale pour augmenter l'efficacité de sécrétion. Pour mieux comprendre la sécrétion chez L. lactis, nous avons identifié des facteurs d'hôtes qui sont impliqués directement ou non dans la sécrétion. Par mutagenèse insertionnelle aléatoire nous avons identifié, puis analysé, deux nouveaux facteurs d'hôtes, dltA et ybdD. L'inactivation de dltA modifie les charges à la surface de la cellule et entraîne la rétention de Nuc sécrétée. L'inactivation de ybdD dérégule l'expression de gènes pouvant contrôler la sécrétion. Tous les composants de la machinerie Sec sont présents, à l'exception de SecDF. Chez B. subtilis, SecDF maintient une forte capacité de sécrétion. La complémentation du sécrétome de L. lactis par SecDF de B. subtilis augmente la sécrétion. Afin d'évaluer la possible utilisation de L. lactis comme vecteur de protéines immunogènes pour déclencher une réponse immune chez la souris, nous avons construit des souches de L. lactis produisant une fusion entre Nuc et un épitope immunogène de la beta-lactoglobuline (Blg). La Blg est l'allergène majeur chez les nourrissons allergiques au lait de vache et constitue un bon modèle d'allergie alimentaire. L'administration orle des souches de L. lactis produisant l'epitope declenche chez la souris une réponse immunitaire mucosale, non allergique, spécifique de la Blg.Lactic acid bacteria (LAB) are Gram-positive bacteria generally considered as safe (GRAS) and they are therefore excellent potential candidates for the development of new uses such as live vectors for the delivery of immunogenic proteins. To this purpose, secretion of heterologous proteins could be more advantageous than cytoplasmic production. We studied the heterologous protein secretion in Lactococcus lactis with the staphylococcal nuclease (Nuc) as secretory model protein. By the use of a lactococcal signal peptide to drive Nuc secretion and a synthetic propeptide to maintain an optimal charge balance at the N-terminal end of Nuc, the Nuc secretion efficiency was strongly improved. To better understand secretion, we identified by random insertional mutagenesis two new host factors indirectly involved in secretion. Inactivation of dltA unbalances charges present at the cell surface and leads to Nuc entrapment into the cell wall. Inactivation of ybdD up-regulates expression of several genes of which products might control secretion in L. lactis. The analysis of the so-called secretome in L. lactis reveals that all components of the Sec machinery are present except SecDF. In B. subtilis, SecDF is necessary in late secretion stages. Introduction of SecDF from B. subtilis into the L. lactis secretome improves secretion of several heterologous proteins. To evaluate the potential use of L. lactis as vector of an allergen to trigger an immune response in mice, we developed L. lactis strains secreting a fusion between Nuc and an immunogenic epitope of b-lactoglobulin (Blg). Blg is the major cow milk allergen in childhood and a good model for study of food allergy. Oral administration of L. lactis secreting this fusion protein triggers a specific mucosal immune and non allergic type response in mice, against both the epitope and the entire Blg.ORSAY-PARIS 11-BU Sciences (914712101) / SudocSudocFranceF

To manage obsolescence risks: anticipate

Cette communication fournit les principes directeurs de la maîtrise des risques liés aux obsolescences des composants électroniques et des substances chimiques (matériaux). En effet, les produits et leurs environnements évoluent en permanence et ces évolutions, parfois difficilement prévisibles, ont un impact direct sur les systèmes développés et opérationnels. Cette communication s’adresse donc aux donneurs d’ordre, mais aussi et surtout aux maîtrises d’oeuvres industrielles et à leurs sous-traitants qui se heurteront à cette problématique tout au long du développement et du MCO de leurs systèmes. Un parallèle entre les composants électroniques et les substances chimiques démontre qu’en matière de gestion des obsolescences, la proactivité est indispensable. Le métier « Composant, énergie et environnement » (C2E) de la Direction technique de la Direction Générale de l’Armement (DGA) a mis en place des outils techniques et contractuels permettant de s’assurer d’une bonne gestion de la pérennité des constituants des systèmes militaires tout au long de leur cycle de vie. S’il fallait résumer en un seul mot les dispositifs mis en oeuvre : ANTICIPATION !This communication provides risk management guidelines related to electronic components and chemicals (materials) obsolescence. Indeed, products and their environments are constantly changing and these changes are sometimes difficult to predict and have a direct impact on operational systems. This communication is therefore available to contracting authority but especially industrial prime contractor and their subcontractors who will face this problem during systems development and operational using and maintenance. A parallel between electronic components and chemicals demonstrates that in terms of obsolescence management, proactivity is required. The department "Component, Energy and Environment" (C2E) of the Technical Directorate of French DoD (DGA) has established contractual and technical tools to ensure good management of components and materials sustainability for military systems throughout their life cycle. If we had to summarize in one word the tools implemented: ANTICIPATION

Expression protéique, protéome Caractérisation des facteurs d'hôtes affectant la sécrétion de protéines hétérologues chez Lactococcus lactis

International audienceCharacterization of host factors affecting heterologous protein secretion in Lactococcus lactis.Lactococcus lactis is the model organism for Lactic Acid Bacteria (LAB) and is a GRAS bacterium. It is therefore a good candidate for the secretion of heterologous proteins of therapeutic interest. In order to investigate new potential uses for LAB, we study host factors involved in the production, the stability and/or the secretion of heterologous proteins in L. lactis. Our strategy uses a random insertional mutagenesis performed on a L. lactis MG1363 derivative strain carrying a uspnuc cassette in its chromosome. The uspnuc cassette encodes a hybrid precursor composed of the signal peptide of the Usp45 secreted protein and the staphylococcal nuclease (Nuc) which is used here as a reporter protein for the secretion process. Nuc activity of bacterial colonies is readily detectable in vivo and this provides an efficient screening for the selection of secretion mutants. We thus selected and analyzed six L. lactis mutants affected in Nuc secretion. Five out of the 6 corresponding genes were identified. Three of them seem to be involved in the production and/or secretion of proteins: 2 genes are homologous to unknown peptidases and one is homologous to a gene located downstream of a transcription regulator. Combination of different strategies should provide new insight of the secretion process in L. lactis and could result in the construction of secretion mutants with enhanced capacities.Lactococcus lactis, bactérie lactique modèle, présente une parfaite innocuité hygiénique. Elle constitue, de ce fait, un bon candidat pour la sécrétion de protéines d'intérêt thérapeutique. Une partie de nos travaux dans ce domaine concerne la caractérisation des facteurs d'hôte impliqués dans la production, la stabilité et/ou la sécrétion de protéines hétérologues chez L. lactis. La stratégie employée consiste en une mutagenèse par transposition aléatoire sur le chromosome. Cette mutagenèse est menée sur une souche de L. lactis portant une cassette uspnuc intégrée sur le chromosome. La cassette uspnuc code pour un précurseur hybride composé du peptide signal d'Usp45, protéine sécrétée par L. lactis, et de la partie mature de la nucléase de Staphylococcus aureus (Nuc) utilisée ici comme protéine rapporteur de la sécrétion. L'activité de Nuc, facilement détectable in vivo sur les colonies bactériennes, constitue un crible efficace pour la sélection de mutants affectés dans la sécrétion. Six mutants de L. lactis affectés dans la sécrétion de Nuc ont ainsi été sélectionnés et analysés. Cinq des 6 gènes correspondants ont été identifiés. Trois semblent particulièrement impliqués dans la production et la sécrétion de protéines : 2 sont homologues à des gènes de peptidases inconnues et un est homologue à un gène situé dans une région potentiellement régulatrice d'un facteur de transcription. Différentes approches par mutagenèse devraient déboucher sur une meilleure connaissance de la machinerie de sécrétion de L. lactis et la construction de mutants hyperproducteurs ou hypersécréteurs

Décret concernant deux chaires de l'Ecole de pharmacie de Strasbourg

Bonaparte Louis-Napoléon, Rouland Gustave. Décret concernant deux chaires de l'Ecole de pharmacie de Strasbourg. In: Bulletin administratif de l'instruction publique. Tome 8 n°95, novembre 1857. pp. 272-273

Transcriptomic Response of Lactococcus lactis in Mixed Culture with Staphylococcus aureus▿ †

The mechanisms of interaction between Lactococcus lactis and the food pathogen Staphylococcus aureus are of crucial importance, as one major role of lactic acid bacteria (LAB) in fermented foods is to inhibit undesirable and pathogenic flora. It was never questioned if the presence of a pathogen can actively modify the gene expression patterns of LAB in a shared environment. In this study, transcriptome and biochemical analyses were combined to assess the dynamic response of L. lactis in a mixed culture with S. aureus. The presence of S. aureus hardly affected the growth of L. lactis but dramatically modified its gene expression profile. The main effect was related to earlier carbon limitation and a concomitantly lower growth rate in the mixed culture due to the consumption of glucose by both species. More specific responses involved diverse cellular functions. Genes associated with amino acid metabolism, ion transport, oxygen response, menaquinone metabolism, and cell surface and phage expression were differentially expressed in the mixed culture. This study led to new insights into possible mechanisms of interaction between L. lactis and S. aureus. Moreover, new and unexpected effects of L. lactis on the virulence of S. aureus were discovered, as described elsewhere (S. Even, C. Charlier, S. Nouaille, N. L. Ben Zakour, M. Cretenet, F. J. Cousin, M. Gautier, M. Cocaign-Bousquet, P. Loubière, and Y. Le Loir, Appl. Environ. Microbiol. 75:4459-4472, 2009)

Synergistic regulation of transcription and translation in Escherichia coli revealed by co-directional increases in mRNA concentration and translation efficiency

International audienceTranslational regulation was investigated at the genome scale in Escherichia coli cells. Using the polysome profiling method, the ribosome occupancy (RO) and ribosome density (RD) of different mRNA copies were determined for several hundred mRNAs during the exponential and stationary phases, providing the most complete characterisation of such regulation in E. coli. Although for most genes, nearly all mRNAs (>90%) were undergoing translation, they were loaded with far fewer than the theoretical maximum number of ribosomes, suggesting translation limitation at the initiation step. Multiple linear regression was used to identify key intrinsic factors involved in the genome-wide regulation of RO and RD (i.e., open reading frame GC%, protein function and localisation). Unexpectedly, mRNA concentration, a factor that depends on cell physiology, was predicted to positively regulate RO and RD during the exponential and stationary phases. Using a set of selected genes controlled by an inducible promoter, we confirmed that increasing the mRNA concentration upon transcription induction led to increases in both RO and ribosome load. The fact that this relationship between mRNA concentration and translation parameters was also effective when E. coli cells naturally adapted to carbon source changes demonstrates its physiological relevance. This work demonstrates that translation regulation is positively controlled by transcript availability. This new mechanism contributes to the co-directional regulation of transcription and translation with synergistic effects on gene expression, and provides a systemic understanding of E. coli cell function

Etude des transcriptomes de Lactococcus lactis et Staphylococcus aureus en interaction en matrice fromagère.

International audienc

Sécrétion de protéines d'intérêt thérapeutique chez Lactococcus lactis

International audienceSecretion of heterologous proteins of therapeutical interest in Lactococcus lactis . The GRAS (for Generally Regarded As Safe) bacterium, Lactococcus lactis, is a good candidate to produce heterologous proteins of vaccinal, medical or technological interest. The secretion of such proteins would allow a direct contact between the protein and its target and therefore would be a better mode of production than intracellular production. To develop heterologous protein export systems in L. lactis, we used the staphylococcal nuclease. We combined these secretion tools to the nisin-inducible controlled expression system. We first developed two new expression vectors allowing the inducible production of Nuc intra- and extracellularly. We then used them to produce in L. lactis two heterologous proteins of therapeutical interest: (i) the ovine omega interferon which possesses antiviral properties and which will be useful to enhance immune response in the case of the use of L. lactis as antigen delivery vehicle and (ii) a fusion protein between the Blg41-60 epitope and the mature part of Nuc.Lactococcus lactis, bactérie lactique modèle, est un micro-organisme GRAS (Generally Regarded As Safe). Sa parfaite innocuité et le développement des connaissances sur ses capacités de production et de sécrétion de protéines hétérologues en font un bon candidat pour la sécrétion de protéines d'intérêt thérapeutique. Notre équipe a développé de nombreux outils d'optimisation de la sécrétion de protéines hétérologues chez L. lactis que nous avons combinés au système d'expression inductible par la nisine. Les deux nouveaux vecteurs d'expression décrits permettent, en fonction des signaux choisis, une expression inductible et une localisation intra- ou extracellulaire de notre protéine modèle, la nucléase de Staphylococcus aureus (Nuc). Nous présentons ici deux exemples d'application de ces outils de sécrétion à des protéines d'intérêt thérapeutique. Les souches décrites permettent : (i) la production d'interféron omega ovin, molécule stimulant la réponse immunitaire, utile pour développer des vaccins vivants et (ii) la production d'une protéine de fusion épitope 41-60 de la $\beta$-lactoglobuline:Nuc, utile pour étudier les phénomènes allergiques liés à la $\beta$-lactoglobuline