Identifizierung zellulärer Zielgene des humanen Papillomvirus Typ 8 (HPV8) in transgenen Mäusen und humanen Keratinozyten

Während die ätiologische Rolle genitaler humaner Papillomviren (HPV) bei der Entstehung des Zervixkarzinoms anerkannt ist, wird die Bedeutung der Infektion mit beta HPV Typen wie HPV8 bei der Entstehung von nicht-melanozytären Hautkrebs noch kontrovers diskutiert. Mit der Etablierung HPV8 transgener Mäuse, die die gesamte frühe Region (GFR = E1/E2/E4/E6/E7) oder nur –E6 bzw. –E2 unter der Kontrolle des humanen Keratin14 Promotors exprimieren, konnte das onkogene Potential von HPV8 in vivo gezeigt werden. Transgene Mäuse entwickelten spontan Hauttumoren und durch einmalige UVA/B-Bestrahlung, welche die Transgenexpression induziert, konnte die Tumorentwicklung innerhalb von drei Wochen synchronisiert werden. Um den Einfluss der HPV8 Onkogene auf die zelluläre Genexpression zu untersuchen, wurden cDNA Micro Array Analysen durchgeführt, die beim Vergleich von nicht-läsionaler HPV8-GFR mit FVB/n wt Maushaut auf eine Deregulation von 17 zellulären Genen hindeutete, von denen 14 in der quantitativen RT-PCR gemessen werden konnten. Dabei wurden StefinA, Sprr2 und Dusp1 als direkte/indirekte HPV8 Zielgene identifiziert. Um die StefinA Expression während der UV-induzierten Papillomatose zu untersuchen, wurden 5 Wochen alte Tiere einmalig bestrahlt. UV-Bestrahlung führte in beiden Mauslinien zu einem starken Anstieg der mRNA Spiegel, wobei in HPV8-GFR transgenen Mäusen bis zum Tag 10 etwas mehr StefinA mRNA gemessen werden konnte als in FVB/n wt Tieren. Im Zuge der Wundheilung beginnend zwischen 7 und 10 Tage nach UV-Bestrahlung sank in den FVB/n wt Tieren die StefinA Expression ab, während die anhaltende Hyperproliferation in HPV8-GFR Tieren mit signifikant erhöhten StefinA mRNA Spiegeln korrelierte. Durch Färbung eines UV-induzierten FVB/n wt Papilloms konnte jedoch gezeigt werden, dass die Überexpression von StefinA in Hauttumoren mit Hyperproliferation assoziiert und unabhängig von der Gegenwart der HPV8 Onkogene ist. Da StefinA aber in HPV8-GFR und –E6 transgenen Mäusen, die im Bezug auf die Papillomentwicklung eine Phänokopie der GFR Tiere darstellen, bereits in nicht-läsionaler Maushaut hochreguliert ist, könnte es auch eine Rolle früh in der HPV8 induzierten Tumorentwicklung spielen. Während in der HPV8-GFR Maus für Syntenin-2, welches laut cDNA Micro Array Vorhersage dereguliert sein sollte, eine Modulation durch das Virus nicht deutlich wurde, konnte in primären humanen Keratinozyten eine Repression der Syntenin-2 Transkription durch HPV8-E6 gezeigt werden. Die Syntenin-2 Proteinspiegel waren in differenzierteren Keratinozyten HPV8-E6 exrimierender Monolayer-Kulturen sowie organotypischer Kulturen experimentell immortalisierter, HPV8-E6 exprimierender nTERT Keratinozyten deutlich erniedrigt. Im Gegensatz zu differenzierten Schichten normaler humaner Epidermis konnte in invasiven Bereichen von Plattenepithelkarzinomen keine Syntenin-2 Expression nachgewiesen werden. Auch in spontan immortalisierten humanen Keratinozyten-Zelllinien waren die Syntenin-2 mRNA Spiegel signifikant erniedrigt und konnten durch HPV8-E6 nicht weiter gesenkt werden. Die biologische Signifikanz der HPV8-E6 vermittelten Syntenin-2 Repression wurde durch spezifischen knock-down in primären Keratinozyten überprüft. Nach Syntenin-2 knock-down kam es zur verlängerten Lebensspanne der primären Keratinozyten sowie wie bei Expression von HPV8-E6 zur Störung der Expression des Differenzierungsmarkers Involucrin in Monolayer-Kultur und der epithelialen Schichtung in der organotypischen Kultur. Dies lässt die Vermutung zu, dass HPV8-E6 die Störung der Differenzierung hauptsächlich über die direkte/indirekte Repression von Syntenin-2 erreicht

Human papillomavirus type 8 E6 oncoprotein inhibits transcription of the PDZ protein syntenin-2

The E6 proteins from high-risk alpha human papillomavirus (HPV) types (e.g., HPV16) are characterized by the presence of a PDZ-binding motif through which they interact with a number of cellular PDZ domain-containing substrates and cooperate in their degradation. The ability of these E6 proteins to bind to PDZ domain proteins correlates with the oncogenic potential of the virus. The E6 proteins of oncogenic HPV from the genus Betapapillomavirus (betaPV, e.g., HPV8) do not encode a PDZ-binding motif. We found that the PDZ domain protein syntenin-2 is transcriptionally downregulated in primary human epidermal keratinocytes (PHEK) by HPV8 E6. The mRNA levels of the known HPV16 E6 PDZ protein targets Dlg, Scribble, Magi-1, Magi-3, PSD95, and Mupp1 were not changed by HPV8 E6. Decreased protein levels of syntenin-2 were observed in cell extracts from PHEK expressing HPV5, -8, -16, -20, and -38 E6 but not in HPV1 and -4 E6-positive keratinocytes. Surprisingly, HPV16 E6 also repressed transcription of syntenin-2 but with a much lower efficiency than HPV8 E6. In healthy human skin, syntenin-2 expression is localized in suprabasal epidermal layers. In organotypic skin cultures, the differentiation-dependent expression of syntenin-2 was absent in HPV8 E6- and E6E7-expressing cells. In basal cell carcinomas of the skin, syntenin-2 was not detectable, whereas in squamous cell carcinomas, expression was located in differentiated areas. Short hairpin RNA-mediated knockdown of syntenin-2 led to an inhibition of differentiation and an increase in the proliferation capacity in PHEK. These results identified syntenin-2 as the first PDZ domain protein controlled by HPV8 and HPV16 at the mRNA level