Absolute proteomic quantification reveals design principles of sperm flagellar chemosensation

© The Author(s), 2020. This article is distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License. The definitive version was published in Troetschel, C., Hamzeh, H., Alvarez, L., Pascal, R., Lavryk, F., Boenigk, W., Koerschen, H. G., Mueller, A., Poetsch, A., Rennhack, A., Gui, L., Nicastro, D., Struenker, T., Seifert, R., & Kaupp, U. B. Absolute proteomic quantification reveals design principles of sperm flagellar chemosensation. Embo Journal, 39(4), (2020): e102723, doi:10.15252/embj.2019102723.Cilia serve as cellular antennae that translate sensory information into physiological responses. In the sperm flagellum, a single chemoattractant molecule can trigger a Ca2+ rise that controls motility. The mechanisms underlying such ultra‐sensitivity are ill‐defined. Here, we determine by mass spectrometry the copy number of nineteen chemosensory signaling proteins in sperm flagella from the sea urchin Arbacia punctulata. Proteins are up to 1,000‐fold more abundant than the free cellular messengers cAMP, cGMP, H+, and Ca2+. Opto‐chemical techniques show that high protein concentrations kinetically compartmentalize the flagellum: Within milliseconds, cGMP is relayed from the receptor guanylate cyclase to a cGMP‐gated channel that serves as a perfect chemo‐electrical transducer. cGMP is rapidly hydrolyzed, possibly via “substrate channeling” from the channel to the phosphodiesterase PDE5. The channel/PDE5 tandem encodes cGMP turnover rates rather than concentrations. The rate‐detection mechanism allows continuous stimulus sampling over a wide dynamic range. The textbook notion of signal amplification—few enzyme molecules process many messenger molecules—does not hold for sperm flagella. Instead, high protein concentrations ascertain messenger detection. Similar mechanisms may occur in other small compartments like primary cilia or dendritic spines.We thank Heike Krause for preparing the manuscript. Financial support by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) via the priority program SPP 1726 “Microswimmers” and the Cluster of Excellence 1023 “ImmunoSensation” is gratefully acknowledged. We thank D. Stoddard for management of the UTSW cryo‐electron microscope facility, which is funded in part by a Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT) Core Facility Award (RP170644). This study was supported by HHS|National Institutes of Health (NIH) grant R01 GM083122 and by CPRIT grant RR140082 to D. Nicastro

Chemosensation at the physical limit by sea urchin sperm

Sperm from the Atlantic purple sea urchin Arbacia punctulata has become an attractive model for studying biological microswimmers and chemotaxis, primarily because of the ease of establishing chemotactic assays in controlled laboratory conditions. More than 100 years of research uncovered the molecular machinery that is responsible for chemosensation and guidance. The sensitivity of the sperm from A. punctulata reaches the limit of what is physically possible, they are able to detect single molecules of the species-specific chemoattractant released by eggs of the same species. Previous studies have investigated sperm signalling at the stimulus level of single to few chemoattractant molecules. These experiments made use of rapid kinetics techniques that provide measurement averages across a large ensemble of sperm cells. While providing valuable insights, these studies are not best-suited to study an inherently stochastic problem. In this thesis, I study single sperm cells while stimulated with single quanta of excitation, i.e., single chemoattractant molecules or single molecules of secondary messenger. For this purpose, I exploit an opto-chemical method in which light is used for a targeted release of molecules. The sperm chemoreceptor, guanylate cyclase, is known for its extraordinary supramolecular arrangement at the flagellar membrane in threads, as well as for negative cooperativity of attractant binding. In my Thesis, I study kinetics of the chemoattractant binding to the sperm guanylate cyclase. Using fluorescently labelled chemoattractant analogues, I determine the rate of attractant unbinding from the receptor at the flagellum. I also reconstruct the kinetic rates for a standalone chemoreceptor, as if it would not be biased by dense receptor clustering and diffusion-limited supply of the attractant. Furthermore, I collect additional evidence towards the hypothesis that the negative cooperativity of the receptor originates from its quaternary structure. Free Gibbs energy of attractant binding is estimated for the sperm guanylate cyclase from the frequency of spontaneous sperm activations. The part of the signalling cascade of sperm chemotaxis that is downstream to the chemoreceptor is also studied by releasing single molecules of the secondary messenger directly inside of the sperm flagellum. Live-cell calcium fluorimetry is massively used to access the signalling state from hundreds of individual spermatozoa with high level of detail. I question the sensitivity of the sperm to cGMP release and prove that essentially stochastic mechanism determines latency of sperm responses to weak stimulations. A mechanism capable of explaining sometimes dramatic delays of sperm responses is proposed. The analysis of the sperm reactions to prolonged and periodically modulated stimuli suggests the presence of an adaptability mechanism in the transduction cascade. Based on these insights, I discuss the physiological relevance of the ultra-sensitivity achieved by sperm. Using digital inline holographic microscopy, I collect trajectories of the sperm swimming far from walls before and after weak stimulation by the secondary messenger. The behavioural responses that I observe suggest that sperm might switch to a different behavioural mode upon binding of a single molecule of the attractant, which presumably primes the active chemotaxis. Up to today, only a handful of model systems have been shown capable of responding to single molecules. This study advances us into understanding how the chemotactic signalling pathways operate at the physical limit. Furthermore, these insights might prove useful in microswimmer designs for application in science and industry.Spermien sind evolutionär für die Bewegung und Navigation von Nutzlast optimiert. Daher werden sie als vielversprechende Grundlage für die Entwicklung von extern kontrollierten Nanorobotern betrachtet. Spermien des Lila Seeigels Arbacia punctulata sind seit Jahrzehnten ein interessantes Modell für die Erfoschung biologischer Mikroschwimmer und Chemotaxis, da chemotaktische Proben mit geringem Aufwand unter Laborbedingungen entnommen werden können. Mehr als 100 Jahre Forschung haben die molekularen Vorgänge aufgeklärt, die für die Chemosensation und Navigation der Spermien verantwortlich sind. Ferner wurde gezeigt, dass die Spermien von A. punctulata die Grenzen des physisch Möglichen erreichen: diese sind in der Lage, einzelne Moleküle des Lockstoffs zu erkennen, die von den Eiern ihrer Spezies abgesondert werden. Allerdings wurden noch nicht alle Mechanismen der Signalkaskade, die die Chemotaxis der Spermien erhält, in allen Details entschlüsselt. Ich untersuche den Lockstoffbindungsprozess des Spermiumrezeptors bezüglich der physikalischen und chemischen Kinetik. Der Chemorezeptor des Spermiums, die Guanylatzyklase, ist für herausragende Affinität zum Lockstoff aber auch für seine außergewöhnliche supramolekulare Anordnung an der Flagellarmembrane in Fäden bekannt, ferner außerdem für seine negative Kooperativität der Lockstoffbindung. Unter Benutzung fluoreszenzmarkierter Lockstoffnachbildungen stelle ich die Reaktionsratenkonstante für den Lockstoff-Rezeptor-Komplex fest. Ferner bringe ich einen weiteren Nachweis dessen, dass die negative Kooperativität des Rezeptors ausschließlich von seiner Quartärstruktur stammt. Die freie Gibbs-Energie der Lockstoffbindung für die Guanylatzyklase des Spermiums schätzte ich ab. Darüber hinaus untersuche ich die Spermien des Seeigels intensiv auf der Ebene einzelner Zellen, um neue Erkenntnisse über die chemotaktische Signalisierung zu gewinnen. Dabei findet eine optochemische Methode Anwendung, in der Licht für die gezielte Freisetzung des sekundären Botenstoffes innerhalb der Spermiengeißel genutzt wird. Dieses Vorgehen erlaubt die Messung der Signalkaskade des Spermiums bei Umgehung des Chemorezeptors. Mittels Calciumfluorometrie von sich schnell bewegenden Spermien und der opto-chemischen Methode zeige ich, dass die Botenstoff-abhängige Phase der Signaltransdukzion weitgehend stochastisch ist. Ich analysiere die Spermienreaktionen zu andauernden und periodisch modulierten Stimulationen und zeige damit die Existenz eines Adaptierungsmechanismus in der Transduktionskaskade an. Diese erhält die Anpassung des dynamischen Bereichs der Chemosensation passend zu den Bedingungen in denen sich das Spermium bewegen muss. Ausgehend von diesen Erkenntnissen diskutiere ich die physiologische Relevanz der Ultrasensitivität für das Spermium. Unter Benutzung von holographischer Mikroskopie habe ich Pfade der Spermienbewegung weit entfernt von Hindernissen vor und nach leichter Pulsstimulation durch den sekundären Boten aufgezeichnet. Anzeichen einer Entscheidungsfindung oder eines multi-modalen Verhaltens der Spermien erlauben die Hypothese, dass die Antwort des Spermiums auf ein einzelnes Molekül eine Verhaltenssteuerung ist, die die Wahrscheinlichkeit der Fortpflanzung erhöht. Diese Studie vertieft das Verständnis der chemotaktischen Signalkaskade des Spermiums des Seeigels, was für die externe Kontrolle der Spermienmobilität essentiell ist, und dient damit der Weiterentwicklung von künstlichen Mikroschwimmern für Forschung und Industrie