Identificación bioinformática y análisis funcional de factores de transcripción de Pseudomonas savastanoi potencialmente implicados en la infección de Mandevilla spp.

La bacteria fitopatógena Pseudomonas savastanoi, perteneciente al complejo Pseudomonas syringae, incluye 4 patovares aislados de diferentes plantas leñosas: pv. savastanoi (olivo), pv. nerii (adelfa), pv. fraxini (fresno) y pv. retacarpa (retama). Recientemente, se ha caracterizado en nuestro grupo un nuevo patovar causante de necrosis bacteriana en la planta ornamental dipladenia (Mandevilla spp.) (Caballo-Ponce, E, 2017, Tesis Doctoral). Estudios filogenéticos han demostrado la estrecha relación entre cepas del patovar nerii (Psn) y las aisladas de Mandevilla spp. (Psm), sin embargo, éstas difieren en el rango de huésped. En este trabajo hemos llevado a cabo un análisis bioinformático comparativo del repertorio de posibles factores de transcripción codificados en los genomas de la cepa Ph3 de Psm y de las cepas de Psn ICMP16943 (capaz de infectar dipladenia y adelfa) y ESC23 (infecta solamente adelfa). De la comparativa bioinformática de un total de 500 posibles factores de transcripción, se han seleccionado 9 de ellos: 3 factores exclusivos de Psm Ph3, 2 factores truncados en Psm Ph3 y 4 factores ausentes en las cepas capaces de infectar dipladenia (Psn ICMP16943 y Psm Ph3). La ausencia/presencia o el truncamiento de los genes codificadores de estos factores se ha comprobado en estas y otras cepas de P. savastanoi mediante técnicas de PCR y secuenciación. Actualmente estamos llevando a cabo la construcción de mutantes en los factores seleccionados para determinar su papel en la infección de dipladenia. Este trabajo pretende contribuir en el conocimiento de los determinantes genéticos implicados en la especificidad de huésped de los diversos patovares de la especie P. savastanoi.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech

Identificación bioinformática y análisis funcional de factores de transcripción de Pseudomonas savastanoi potencialmente implicados en la infección de Mandevilla spp.

La bacteria fitopatógena Pseudomonas savastanoi, perteneciente al complejo Pseudomonas syringae, incluye cuatro patovares aislados de diferentes plantas leñosas: pv. savastanoi (olivo), pv. nerii (adelfa), pv. fraxini (fresno) y pv. retacarpa (retama). Recientemente, se ha caracterizado en nuestro grupo un nuevo patovar (Psm) causante de necrosis bacteriana en la planta ornamental dipladenia (Mandevilla spp.) (Caballo-Ponce, E, 2017, Tesis Doctoral). Estudios filogenéticos han demostrado la estrecha relación existente entre cepas del patovar nerii (Psn) y las aisladas de Mandevilla spp., aun cuando éstas difieren en el rango de huésped. En este trabajo hemos llevado a cabo un análisis bioinformático comparativo del repertorio de posibles factores de transcripción (Fts) codificados en los genomas de la cepa Ph3 de Psm y de las cepas de Psn ICMP16943 y ESC23. La búsqueda se centró en aquellos Fts posiblemente implicados en la infección de dipladenia, seleccionando un total de nueve posibles Fts: tres factores exclusivos de Psm Ph3, dos factores truncados exclusivamente en Psm Ph3 y cuatro factores ausentes tanto en Psn ICMP16943 como Psm Ph3 (las dos cepas que infectan dipladenia). De entre los TFs identificados, hemos seleccionados tres que forman parte de un posible operón junto a otros genes implicados en quimiotaxis. Se han construido mutantes de este operón en cada uno de los tres genes codificadores de los Fts seleccionados y en dos genes codificadores de Methyl Chemotaxis proteins (MCP). Actualmente estamos analizando el papel de estos genes en la patogenicidad en plantas de dipladenia y su implicación en quimiotaxis. Este trabajo pretende contribuir en el conocimiento de los determinantes genéticos implicados en la especificidad de huésped de los diversos patovares de la especie P. savastanoi.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech

Characterization of the GacS/GacA system in the virulence regulation in Pseudomonas savastanoi.

The two-component regulatory system GacS/GacA is one of the main mechanisms for global regulation in bacteria. GacS/GacA is a highly conserved system that has been studied in many pathogenic bacteria. However, its characterization has been mainly focused on pathogenic bacteria of herbaceous plants. Despite previous works have reported that GacS/GacA regulates the expression of virulence factors, its role in virulence varies among different species and strains. The aim of this work was the identification of virulence factors regulated by the GacS/GacA system in the model bacterium Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi (Psv), causal agent of olive knot disease. To this end, we generated a gacA deletion mutant in the strain Psv NCPPB 3335, whose transcriptomic profile was further analyzed using a massive RNA sequencing (RNA-seq) strategy. The bioinformatic analysis of RNA-seq data showed that the Psv GacS/GacA system regulates a large number of genes, including some virulence factors already described, such as those related to the type III secretion system, the biosynthesis of phytohormones and the catabolism of aromatic compounds, among others. In addition, small Rsm-type RNAs and regulatory proteins (RsmA) were identified in the regulatory cascade of the GacS/GacA system. Finally, the involvement of some of the virulence factors of Psv NCPP 3335 were further studied through different phenotypic assays, such as plant virulence assays, induction of hypersensitive response, leaf adhesion tests and translocation of type III effectors. Results obtained in this work indicate that GacS/GacA system presents a role in regulation of virulence factors of Psv NCPPB 3335.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech

Caracterización del sistema de dos componentes GacS/GacA en Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi

El sistema de dos componentes GacS/GacA es considerado uno de los principales mecanismos de regulación global en bacterias. Mayoritariamente, los trabajos de caracterización del sistema GacS/GacA se han centrado en bacterias patógenas de plantas herbáceas, donde su papel en virulencia es variable entre distintas especies y cepas. En este trabajo, nos hemos centrado en la identificación de los factores de virulencia regulados por el sistema GacS/GacA en la bacteria modelo Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi (Psv), agente causal de la tuberculosis del olivo. Para ello, hemos llevado a cabo un análisis de secuenciación masiva del RNA (RNA-seq) utilizando la cepa silvestre Psv NCPPB 3335 y un mutante gacA. El análisis bioinformático de los resultados obtenidos muestra que el sistema GacS/GacA de Psv participa en la regulación de un gran número de genes, incluyendo varios factores de virulencia previamente descritos, como el sistema de secreción tipo III, las fitohormonas o una región genómica implicada en el catabolismo de compuesto aromáticos. Además, se han identificado los pequeños RNAs tipo Rsm y las proteínas reguladoras (RsmA) que participan en la cascada de regulación del sistema GacS/GacA. Finalmente, hemos realizado ensayos fenotípicos (ensayos de virulencia en planta, inducción de respuesta hipersensible, síntesis de auxinas, adhesión a hojas y translocación de efectores) para determinar la implicación de algunos de los factores de virulencia identificados por RNAseq en la virulencia de Psv NCPP 3335

Host specificity in Pseudomonas savastanoi pathovars of woody hosts: comparative genomics and gene regulation

Conferencia por invitación a la sesión 11 del congreso "Genomics and Gene Regulation - I"Pseudomonas savastanoi belongs to the intensively studied Pseudomonas syringae complex, and includes four pathovars causing knots or excrescences in woody hosts. These are P. savastanoi pv. savastanoi (Psv), pv. nerii (Psn), pv. fraxini (Psf) and pv. retacarpa (Psr), comprising isolates from olive (Olea europaea), oleander (Nerium oleander), ash (Fraxinus excelsior) and Spanish broom (Retama sphaerocarpa), respectively. The recent availability of the draft genome sequences of several P. savastanoi strains isolated from different hosts has facilitated bioinformatics-based predictions of virulence determinants in this pathogen, including codification of phytohormones-related genes and type III secretion system effectors (T3E). The super-repertoire of T3E in the P. savastanoi pangenome comprises a core set of 21 effectors, some of which are truncated in the genomes of strains belonging to specific pathovars, suggesting a role of these proteins in host specificity. To address this issue, we have constructed both knock out mutants in some of these genes and strains expressing heterologously the complete version of the truncated effectors. Classification of P. savastanoi pathovar-specific genes into biological functions using Blast2GO revealed that most specific genes were included in the category “regulation of transcription”. Thus, we decided to construct a pipeline allowing the identification of regulatory elements in bacterial genomes. Our preliminary results indicate that P. savastanoi strains show significant differences in the number of transcriptional regulatory proteins (TFs), ranging from about 380 to 440. The role of some of these TFs in virulence and host specificity is currently under analysis and the results will be presented. This project is supported by the Spanish Plan Nacional I+D+i grants AGL2017-82492-C2-1-R and AGL2017-82492-C2-2-R, co-financed by The Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER).Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech

El sistema de dos componentes GacS/GacA regula la expresión de factores de virulencia y patogenicidad en Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi NCPPB3335.

GacS/GacA es uno de los principales sistemas de regulación global en bacterias gramnegativas. Trabajos previos realizados con bacterias patógenas de plantas herbáceas han descrito cómo el sistema GacS/GacA interviene en la regulación de diversos factores de virulencia. Sin embargo, la regulación de estos factores muestra variabilidad no solo entre especies, sino también entre cepas. En este trabajo, hemos estudiado el papel regulador del sistema GacS/GacA en la virulencia y patogenicidad de la cepa NCPPB 3335 de P. savastanoi pv. savastanoi (Psv), agente causal de la enfermedad conocida como tuberculosis del olivo. Para ello, se construyó un mutante por deleción del gen gacA, en la cepa Psv NCPPB3335, cuyo perfil transcriptómico se analizó globalmente mediante una estrategia de secuenciación masiva de ARN (RNA-seq). El análisis bioinformático de los datos de RNA-seq mostró que el sistema GacS/GacA de Psv regula la expresión de genes relacionados con el sistema de secreción tipo III (T3SS), la síntesis de auxinas, locomoción y quimiotaxis bacteriana, y la degradación de compuestos fenólicos asociada a la invasión de huéspedes leñosos. Además, se identificaron variaciones en los niveles de expresión de pequeños ARN de tipo Rsm y proteínas reguladoras (RsmA), elementos que intervienen en la cascada de regulación del sistema GacS/GacA. Con la intención de profundizar en la caracterización de este sistema, se han llevado a cabo ensayos fenotípicos complementantes, como ensayos de virulencia en plantas, inducción de respuesta hipersensible, sensibilidad a peróxido de hidrógeno y translocación de efectores tipo III.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech

Role of chemotaxis cluster II in pathogenic bacteria of woody and herbaceous plants.

Chemoreceptors are essential proteins able to detect environmental changes for bacterial adaptation to the environment. The genes encoding these proteins are found individually in the genome or forming clusters with other genes related to chemotaxis. In plant-pathogenic bacteria, about 82 thousand chemosensory sequences have been described (1). In the Pseudomonas syringae complex, one of the most important groups of plant-pathogenic bacteria, four chemotaxisrelated clusters have been described. However, one of these clusters, named cluster II, is absent in some bacteria of this complex infecting woody hosts of the Apocinaceae family. Examples of the absence of this cluster are strains of Pseudomonas savastanoi pv. mandevillae (Psm) and some strains of P. savastanoi pv. nerii (Psn), isolated from dipladenia (Mandevilla spp.) and oleander (Nerium oleander), respectively. Therefore, the aim of this work focuses on the functional characterization of cluster II, not only in bacteria isolated from woody hosts, but also in strains infecting herbaceous plants. First, we constructed knockout mutants of most genes encoded in cluster II, i.e. cheA, cheB, cheD, cheY and two genes coding for chemoreceptors in a woody plant pathogenic strain, both in Psn23 strain and in P. syringae pv. tomato (Pto) DC3000. Motility and virulence assays performed in oleander, dipladenia and tomato plants revealed that cluster II is involved in both phenotypes. In addition, bioinformatic analysis of the ligand-binding domain (LBD) (1) of the two chemoreceptors encoded in cluster II showed that only one of them has an LBD domain. To characterise this chemoreceptor in strain Psn23, capillarity chemotaxis assays are being performed, and its LBD domain has been purified. The purified domain will be used in protein-ligand interaction assays against a collection of plant-derived compounds.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech