Veränderung der neuronalen Vasoregulation im mesenterialen Gefäßbett bei portaler Hypertension: mit besonderem Fokus auf die neuronale Stickstoffmonoxyd-Synthase (nNOS)-vermittelte Vasorelaxation und die Neuropeptid Y (NPY)-induzierte Vasokonstriktion

Veränderung der neuronalen Vasoregulation im mesenterialen Gefäßbett bei portaler Hypertension: mit besonderem Fokus auf die neuronale Stickstoffmonoxyd-Synthase (nNOS)-vermittelte Vasorelaxation und die Neuropeptid Y (NPY)-induzierte Vasokonstriktion. Hintergrund und Ziele: 1. Die splanchnische arterielle Vasodilatation ist ein pathophysiologische Faktor bei der Entwicklung des hyperdynamen Zirkulationssyndroms. Die Dilatation konnte auf eine vaskuläre NO-Überproduktion zurückgeführt werden. Die n(euronale)-NOS wurde bisher nicht untersucht, und von daher ist das Ziel dieser Arbeit die nNOS-Protein Expression und die nNOS-vermittelte Vasorelaxation an portal-venös-ligierten Ratten zu charakterisieren. 2. HSP90 stimuliert die Aktivität der nNOS. Bislang konnte noch nicht nachgewiesen werden, dass die nNOS-Aktivität in PVL-Ratten aufgrund von HSP90 größer ist, als in Sham-Ratten. Um eine direkte Interaktion von nNOS/HSP90 nachzuweisen wurde eine Co-Immunpräzipitation durchgeführt. 3. Die kompensatorische Stimulation des sympathischen Nervensystems konnte anhand von gesteigerten Serumspiegeln an Noradrenalin (NA) gezeigt werden. Neuropeptide Y (NPY) liegt zusammen mit NA in präsynaptischen Vesikeln vor, wird nach starker sympathischer Nervenstimulation sezerniert und wirkt als ein Cotransmitter. Veränderungen in der Freisetzung und den vasoaktiven Effekten von NPY in der splanchnischen Zirkulation bei Hypertension wurden bisher noch nicht untersucht. In der folgenden Studie wurde zudem noch der Effekt von NPY auf die nNOS-vermittelte Vasodilatation analysiert. Methoden: 1. Das mesenteriale Gefäßbett wurde mittels Immunhistochemie nNOS-spezifisch gefärbt, und die nNOS-Proteinmenge mittels Wester Blot quantifiziert. Das deendothelisierte mesenteriale Gefäßbett wurde in vitro perfundiert und mit NA präkonstriktiert (EC80). Durch eine periarterielle Nervenstimulation (PNS, 2-12 Hz, 45V) wurde die Vasodilatation durch Zugabe des Inhibitors L-NAME (10-4 M) und des nNOS-spezifischen Hemmstoffes TRIM (10-4 M) untersucht. 2. Das Protokoll für die Untersuchung des Einflusses von HSP90 auf die nNOS-vermittelte Vasorelaxation bei PVL-/Sham-Ratten ist identisch mit dem oben beschriebenen Protokoll. Anstelle von L-NAME wurde Geldanamycin (10-4 M) vor dem zweiten Perfusionszyklus zugegeben. 3. Der Einfluss von NPY (10-8 M) auf die vaskulären Effekte von Methoxamin (MT: alpha1-adrenerger -Agonist) wurde durch Perfusion des mesenterialen Gefäßbettes beider Tiergruppen untersucht. Zur Charakterisierung des Einflusses von NPY auf die nNOS-vermittelte Vasorelaxation wurde das gleiche Versuchsprotokoll-wie oben erwähnt-verwendet; und dabei NPY vor dem zweiten Perfusionszyklus in einer Konzentration von 8 x 10-8 M zugegeben. Ergebnisse: 1. nNOS ist in der Adventitia von mesenterialen Gefäßen lokalisiert, wobei die PVL-Tiere eine deutlich stärke Färbung zeigten. Die Proteinmenge in den mesenterialen Arterien der PVL-Tiere stark erhöht. Die PNS führte zu einer frequenzabhängigen Vasorelaxation, die in den PVL- stärker ausgeprägt war. Dieser Unterschied der neuronal-vermittelten Vasorelaxation wurde durch die Gabe von L-NAME/TRIM aufgehoben. Der Effekt der Hemmung von der nNOS-vermittelten Vasorelaxation war bei den PVL-Tieren signifikant größer als bei Sham-Tieren. 2. Die Co-Immunpräzipitation zeigte eine Interaktion von HSP90 und nNOS. Durch Geldanamycin wurde der Unterschied zwischen den PVL- und Sham-Ratten aufgehoben, der Effekt der verminderten NO-Freisetzung bei den PVL-Tieren war signifikant größer. Geldanamycin erwies sich als ein ähnlich guter Inhibitor wie L-NAME. 3. Die vaskuläre Hyporeaktivität gegenüber MT im mesenterialen Gefäßbett von PVL-Tieren wurde durch NPY korrigiert. NPY steigerte die vaskuläre Sensitivität, führte aber nur bei den PVL-Tieren zu einer gesteigerten Kontraktilität. Die durch NPY bedingte Änderung der MT-Antwort war bei den PVL-Ratten signifikant stärker als bei den Sham-Tieren. Die Gabe von NPY führte zu einer Hemmung der nNOS-vermittelten Vasorelaxation. Schlussfolgerung: 1. Die perivaskuläre nNOS Protein Expression ist im mesenterialen Gefäßbett bei portaler Hypertension erhöht und bedingt eine gesteigert NO-vermittelte Vasorelaxation. Diese nNOS-abhängige NO Überproduktion könnte eine wichtige Rolle bei der Pathogenese der arteriellen Vasodilatation und beim hyperdynamen Zirkulationssyndrom spielen. 2. Die HSP90/nNOS Interaktion verstärkt die PNS-vermittelte NO-Freisetzung. Diese Ergebnisse zeigen, dass der größte Teil der nNOS-vermittelten Vasorelaxation im mesenterialen Gefäßbett bei portaler Hypertension durch HSP90 moduliert wird. 3. Der vasokonstriktive Effekt von NPY im mesenterialen Gefäßbett ist im Vergleich bei den PVL-Tieren stärker ausgeprägt. NPY stellt die vaskuläre Hyporeaktivität wieder her und ist somit ein Agens was die vaskulär verminderte Antwort auf Konstriktoren bei portaler Hypertension wieder herstellt

From Lab to Lake - Evaluation of Current Molecular Methods for the Detection of Infectious Enteric Viruses in Complex Water Matrices in an Urban Area.

Quantitative PCR methods are commonly used to monitor enteric viruses in the aquatic environment because of their high sensitivity, short reaction times and relatively low operational cost. However, conclusions for public health drawn from results of such molecular techniques are limited due to their inability to determine viral infectivity. Ethidium monoazide (EMA) and propidium monoazide (PMA) are capable to penetrate the damaged or compromised capsid of the inactivated viruses and bind to the viral nucleic acids. We assessed whether dye treatment is a suitable approach to improve the ability of qPCR to distinguish between infectious and non-infectious human adenovirus, enterovirus and rotavirus A in surface water of an urban river and sewage before and after UV disinfection. Like the gold standard of cell culture assays, pretreatment EMA-/PMA-qPCR succeeded in removing false positive results which would lead to an overestimation of the viral load if only qPCR of the environmental samples was considered. A dye pretreatment could therefore provide a rapid and relatively inexpensive tool to improve the efficacy of molecular quantification methods in regards to viral infectivity

Capsid integrity qPCR—an Azo-dye based and culture-independent approach to estimate adenovirus infectivity after disinfection and in the aquatic environment

Recreational, reclaimed and drinking source waters worldwide are under increasing anthropogenic pressure, and often contain waterborne enteric bacterial, protozoan, and viral pathogens originating from non-point source fecal contamination. Recently, the capsid integrity (ci)-qPCR, utilizing the azo-dyes propidium monoazide (PMA) or ethidium monoazide (EMA), has been shown to reduce false-positive signals under laboratory conditions as well as in food safety applications, thus improving the qPCR estimation of virions of public health significance. The compatibility of two widely used human adenovirus (HAdV) qPCR protocols was evaluated with the addition of a PMA/EMA pretreatment using a range of spiked and environmental samples. Stock suspensions of HAdV were inactivated using heat, UV, and chlorine before being quantified by cell culture, qPCR, and ci-qPCR. Apparent inactivation of virions was detected for heat and chlorine treated HAdV while there was no significant difference between ci-qPCR and qPCR protocols after disinfection by UV. In a follow-up comparative analysis under more complex matrix conditions, 51 surface and 24 wastewater samples pre/post UV treatment were assessed for enteric waterborne HAdV to evaluate the ability of ci-qPCR to reduce the number of false-positive results when compared to conventional qPCR and cell culture. Azo-dye pretreatment of non-UV inactivated samples was shown to improve the ability of molecular HAdV quantification by reducing signals from virions with an accessible genome, thereby increasing the relevance of qPCR results for public health purposes, particularly suited to resource-limited low and middle-income settings.Published versio

Enhanced Y1-receptor-mediated vasoconstrictive action of neuropeptide Y (NPY) in superior mesenteric arteries in portal hypertension

BACKGROUND/AIMS: Vascular hyporeactivity to catecholamines contributes to arterial vasodilation and hemodynamic dysregulation in portal hypertension. Neuropeptide Y (NPY) is a sympathetic neurotransmitter facilitating adrenergic vasoconstriction via Y1-receptors on the vascular smooth muscle. Therefore, we investigated its role for vascular reactivity in the superior mesenteric artery (SMA) of portal vein ligated (PVL) and sham operated rats. METHODS: In vitro perfused SMA vascular beds of rats were tested for the cumulative dose-response to NPY dependent on the presence and level of alpha1-adrenergic vascular tone (methoxamine MT: 0.3-10 microM). Moreover, the effect of NPY (50 nM) on vascular responsiveness to alpha1-adrenergic stimulation (MT: 0.3-300 microM) was evaluated. Y1-receptor function was tested by Y1-selective inhibition using BIBP-3226 (1 microM). RESULTS: NPY dose-dependently and endothelium-independently enhanced MT-pre-constriction in SMA. This potentiation was increasingly effective with increasing adrenergic pre-stimulation and being more pronounced in PVL rats as compared to sham rats at high MT concentrations. NPY enhanced vascular contractility only in PVL rats correcting the adrenergic vascular hyporeactivity. Y1-receptor inhibition completely abolished NPY-evoked vasoconstrictive effects. CONCLUSIONS: NPY endothelium-independently potentiates adrenergic vasoconstriction via Y1-receptors being more pronounced in portal hypertension improving mesenteric vascular contractility and thereby correcting the splanchnic vascular hyporeactivity. This makes NPY a superior vasoconstrictor counterbalancing arterial vasodilation in portal hypertension

Role of HSP-90 for increased nNOS-mediated vasodilation in mesenteric arteries in portal hypertension

AIM: To explore the role of heat shock protein-90 (HSP-90) for nitrergic vasorelaxation in the splanchnic circulation in rats with and without portal hypertension

Sequences, size of the amplicon and target region of the primer and probe sets used for the qPCR detection of human Adenovirus (HAdV), enterovirus (EV), murine norovirus (MNV) and rotavirus (RV) in environmental samples.

<p>Sequences, size of the amplicon and target region of the primer and probe sets used for the qPCR detection of human Adenovirus (HAdV), enterovirus (EV), murine norovirus (MNV) and rotavirus (RV) in environmental samples.</p

Occurrence of HAdV, EV and RoV in the combined, surface, total sewage water samples and before and after UV treatment.

<p>Occurrence of HAdV, EV and RoV in the combined, surface, total sewage water samples and before and after UV treatment.</p