Desarrollo de metodologías analíticas y estudios sobre la aplicabilidad de las proteínas de fase aguda como biomarcadores de salud y bienestar animal en el perro. Caracterización de ITIH4 como nueva proteína de fase aguda canina

La concentración de proteínas de fase aguda (PFA) se eleva en el perro en diferentes situaciones patológicas. Aunque no es un parámetro que permita determinar la causa de la elevación y no pueden utilizarse como un test primario para la detección de una determinada enfermedad, estas proteínas presentan una elevada sensibilidad para la detección de situaciones que alteran la salud del animal y pueden proporcionar evidencia de que el animal presenta inflamación o infecciones subclínicas. Se han publicado numerosos estudios que describen las PFA como biomarcadores en diferentes tipos de enfermedades que afectan a la especie canina y el interés de su uso como biomarcadores de salud y bienestar animal ha ido incrementando en las últimas décadas. Sin embargo la falta de una metodología específica de especie adecuadamente validada se ha considerado como una de las principales limitaciones para la incorporación de estos parámetros en la clínica. El origen de esta tesis se encuentra en trabajos pioneros llevados a cabo en el departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Celular por el grupo del profesor Lampreave, que llevaron a cabo la caracterización de la respuesta de fase aguda en la especie porcina y el descubrimiento de la Pig-MAP, nueva proteína sérica y principal PFA en el cerdo, también conocida como ITIH4. Posteriormente se estudió la nueva proteína ITIH4 en otras especies como la humana, bovina y ovina donde también se comporta como una PFA positiva.En esta tesis se continúan estos estudios centrados en la especie canina. El objetivo general de este trabajo ha sido caracterizar la respuesta de la ITIH4, junto con otras PFA caninas ya conocidas (CRP, Hp y GPA) en diferentes procesos inflamatorios o enfermedades caninas. En este trabajo se ha aislado y caracterizado por primera vez la ITIH4 en la especie canina, que al igual que en el resto de las especies en las que se ha estudiado, consta de una única cadena polipeptídica de 120 KDa. Además se han purificado CRP, Hp y GPA con un alto grado de pureza. Las proteínas purificadas (ITIH4, CRP, Hp y GPA) se utilizaron para inmunizar conejos y obtener antisueros específicos que reconocían la proteína de interés. Los antisueros específicos se utilizaron para desarrollar y validar métodos analíticos robustos, que han permitido cuantificar cada una de estas proteínas en muestras de suero de perro. Se ha desarrollado un método de inmunodifusión radial (IR) y un ELISA tipo sándwich, que han permitido cuantificar por primera vez la ITIH4 canina en muestras de suero. A su vez, también se han desarrollado tres métodos de IR para la cuantificación de CRP, Hp y GPA caninas y un ELISA tipo sándwich para la Hp. La determinación de la concentración de ITIH4 canina, junto con el resto de PFA purificadas (CRP, Hp y GPA) en muestras de suero de animales sometidos a estímulos inflamatorios de diferente origen (cirugía, piometra, infección experimental con Leishmania infantum) ha permitido caracterizar a esta proteína como proteína de fase aguda moderada en la especie canina, tanto por el incremento que experimenta en su concentración tras los diferentes estímulos inflamatorios, como por la cinética mostrada tras la infección experimental con L. infantum. La toma de muestra en el tiempo inmediato tras la infección experimental con L. infantum ha permitido observar por primera vez una respuesta inflamatoria fuerte y temprana, caracterizada por un aumento de CRP, ITIH4 y Hp con valores máximos a las 24 -48 h, dependiendo de la PFA. Los valores de PFA volvieron a aumentar de forma mas moderada entre los 8 – 10 meses post-infección, coincidiendo en términos generales con la aparición de los síntomas clínicos. CRP e ITIH4 mostraron una correlación positiva y moderada con el título de anticuerpos anti Leishmania que presentaba el animal y también con la sintomatología clínica. La cuantificación de CRP, ITIH4, Hp y GPA en sueros de perros clínicamente sanos, ha permitido establecer un intervalo de referencia, para cada una de estas proteínas, para los métodos analíticos desarrollados. Adicionalmente se ha realizado un estudio en colaboración con la Asociación Española de Veterinarios Municipales (AVEM), que ha permitido evaluar el uso de estas PFA como marcadores de bienestar animal en perros alojados en centros de protección. En este estudio se ha encontrado una asociación de los niveles séricos de CRP y Hp presentes en animales alojados en centros de protección y las características de los diferentes centros estudiados, pudiendo asociarse niveles mas elevados de estas proteínas a características de los centros que pueden producir un menor estado de bienestar en el animal.<br /

Expresión diferencial de las Proteínas de fase aguda en ratón causada por infección crónica con Brucella suis e infección aguda por Brucella microti

La brucelosis es una zoonosis de amplia distribución en nuestro país, que causa unas grandes pérdidas económicas en nuestra ganadería y produce más de un millar de casos humanos anualmente. En los últimos años se han descrito nuevas especies de Brucella consideradas como patógenos emergentes. Es necesario definir su virulencia así como estudiar su posible utilización como cepa vacunal para la profilaxis de la brucelosis animal. Una de estas últimas cepas descubiertas es Brucella microti, que ha sido descrita como patógeno del topillo. En este estudio se ha mostrado como altamente virulenta en un modelo murino puesto a punto en el Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentaria de Aragón (CITA) de Zaragoza. Se han realizado dos infecciones, comparando B. microti con la cepa de referencia B. suis. La mayor virulencia de B. microti produjo una infección aguda en ratón, a diferencia de la cepa de referencia B. suis, que provocó una infección crónica. La respuesta contra el lipopolisacárido bacteriano en la cepa de referencia (B. suis) apareció a los 28 días de infección. Con el objetivo de determinar si una infección por Brucella se puede monitorizar en suero y diferenciar entre una infección aguda (B. microti) y una infección crónica (B. suis) se han cuantificado nueve proteínas de fase aguda. Las proteínas de fase aguda aumentan o disminuyen en respuesta a un daño tisular o una infección que representan una amenaza para la integridad del organismo mediante alteraciones en los mecanismos homeostáticos, provocando una respuesta de fase aguda. Las diferencias en la virulencia se han reflejado en una respuesta diferente por parte del huésped. De las nueve proteínas cuantificadas, se han confirmado como proteínas de fase aguda cinco de ellas (haptoglobina, SAA, GPA, hemopexina e ITIH4). También se observó un aumento de la CRP e ICP en la infección por B. microti y un aumento de la transferrina en la infección por B. suis. La Apo A1 no varió en ninguna de las infecciones. Por todo ello es posible diferenciar una infección aguda (B. microti) de una infección crónica (B. suis) en estas condiciones experimentales

Comparación de las proteínas de fase aguda expresadas en suero de ratón por infección de referencia con Brucella suis y una nueva cepa emergente aislada de ranas

La respuesta de fase aguda (RFA) comprende una serie de procesos fisiológicos y metabólicos que se inducen ante situaciones que representan una amenaza para el organismo (infecciones…) y que alteran los mecanismos homeostáticos, con el fin de que éste vuelva a la situación normal. Un aspecto peculiar de la RFA es el papel fundamental que tiene el hígado, en el que se producen múltiples cambios que tienen como consecuencia la modificación de los niveles de proteínas plasmáticas sintetizadas por él, conocidas como proteínas de fase aguda (PFA). La brucelosis es una zoonosis de amplia distribución en nuestro país que causa grandes pérdidas económicas en nuestra ganadería y que produce más de un millar de casos humanos anualmente. La gestión sanitaria de la brucelosis humana está directamente relacionada con la eliminación de la brucelosis animal, por lo que la investigación orientada al desarrollo de una mejor profilaxis animal está plenamente justificada. En los últimos años se han aislado nuevas especies de Brucella en distintos huéspedes de las que se desconoce su virulencia y capacidad de transmisión a los animales de interés económico y al hombre. Una de estas últimas cepas ha sido descrita como patógeno de la rana (Brucella spp. BR3). La hipótesis que se ha planteado en este trabajo es que “las PFA en ratón podrían servir para monitorizar la infección por Brucella y distinguir una infección crónica (propia de B. suis) de una infección moderada (propia de BR3)”. El objetivo principal de este trabajo ha sido determinar las PFA en ratón y su posible uso como biomarcadores de infección por B. suis y BR3. En este estudio se ha visto que la infección realizada con BR3 es crónica, al igual que la de la cepa de referencia B. suis, ya que los ratones no consiguen eliminar las bacterias en el periodo de tiempo estudiado (tres meses). El peso y las unidades formadoras de colonias (UFC) en hígado/bazo evidencian que la cepa B. suis es más virulenta. En ambas infecciones se ha observado un aumento significativo en las concentraciones séricas de la haptoglobina (Hp), la hemopexina (Hx), el amiloide A sérico (SAA), la cadena pesada 4 del inhibidor de la tripsina inter-α (ITIH4) y la α1-glicoproteína ácida (GPA) durante la RFA, siendo mucho menor para la cepa BR3; por ello, los valores de la concentración de estas PFA permiten distinguir el tipo de infección. La transferrina (Tf) sólo aumenta en la infección por B. suis. La apolipoproteína A1 (ApoA1), la proteína C reactiva (CRP) y el inhibidor de la α1-cisteína proteasa (ICP) no varían en ninguna de las dos infecciones, por lo que no pueden considerarse PFA en ratón. Se ha detectado la respuesta de inmunoglobulinas (Igs) totales y de IgG3 contra el lipopolisacárido (LPS) de B. abortus, principal antígeno común de las cepas lisas de Brucella, a partir del día 28 post-infección por B. suis