The effects of voriconazole exposure on zygomycetes' virulence

Invasive fungal infections are a major cause of morbidity and mortality inimmunocompromised hosts as well as bone marrow transplant recipients (1). Theincreasing incidence of invasive fungal infections has led to the use of VRC prophylaxisin patients at high risk (2). Despite its wide spectrum, VRC has no activity against theZygomycetes (3), which have been responsible for an increasing number of invasivefungal infections in immunocompromised patients (1, 4). Recent studies correlate theincreasing incidence of Zygomycetes infections with the increasing use of VRCprophylaxis (1, 2, 5-9). Given their complex and largely unknown pathogenesis, it isunclear whether VRC prophylaxis favors growth of Zygomycetes by creating selectionpressure or by altering their virulence. In order to test the latter hypothesis we assessedthe effect of VRC exposure on Zygomycetes virulence in two phylogenetically disparateanimal models of zygomycosis using Drosophila melanogaster fruit flies and Balb/C mice.Materials and methodsWe used 3 clinical Zygomycetes isolates (Rhizopus oryzae 557969, Rhizopus oryzae518749 και Mucor circinelloides 48812) and one reference Aspergillus isolate (Aspergillusfumigatus 293). Conidia of each isolate were exposed to VRC, itraconazole, caspofungin or amphotericin B with serial passages through culture plates containing sub-inhibitoryconcentrations of each drug (13). As controls, the same isolates were serially passaged on drug-free culture plates. For the animal model of zygomycosis in D.melanogaster, weused Oregon wild type (Wt) flies as well as Toll (Tl) flies that lack the toll pathwaywhich protects them from most fungal pathogens, but not the Zygomycetes (12, 13).Infection was performed by inserting a thin needle previously dipped in a suspensionof spores (106 cells/mL) into the thorax of each fly. Survival was assessed until day 8after infection. For the mammalian animal model of zygomycosis we used femaleBalb/C mice, immunosupressed with cortisone acetate (14). Mice were infected withintranasal instillation of a droplet of a spore suspension of R.οryzae 557969 in twodifferent concentrations (5x104 cells/ml and 106 cells/ml) and survival was assessed for10 days after infection.For the histopathological analysis, whole-lung tissue samples were obtainedfrom euthanized mice in each infection group and stained with hematoxylin-eosin,Grocott-Gomori methenamine silver nitrate and cresyl violet. For the analysis of fungalburden, we used qPCR analysis of DNA extracted from mice lung homogenates. For theassessment of differences in the expression of inflammation associated genes in mice weused micro-arrays analysis of RNA extracted from lung homogenates of mice that wereinfected with VRC exposed or non VRC exposed R.οryzae as well as control mice that were not infected at all.Survival curves for the mice and flies following infection were plotted usingKaplan-Meier analysis, and differences in the survival rates between groups wereassessed using the log-rank test. The pulmonary fungal burden (measured in terms of spore equivalents) in the groups of mice was compared using the Mann-Whitney U test.Gene expression in mouse infection groups was compared using the unpaired Student ttest. P values were corrected for multiple comparisons using the Benjamini-Hochbergmethod. For all comparisons, P values <0.05 were considered statistically significant.ResultsInoculation of Wt flies with R.oryzae 557969 resulted in acute infection with 39%mortality, while previous exposure of conidia to VRC increased mortality to 65%(P<0.001). Infection of Tl flies with the same isolate resulted in 54% mortality (82% withprevious exposure of conidia to VRC, P<0.001). Infection of Wt flies with R. oryzae518749 resulted in 64% mortality that increased to 80% when conidia had been exposedto VRC before the infection (P=0.03). Infection of Tl flies with the same isolate resultedin 81% mortality (95% with pre-exposure to VRC, P<0.001). Both Wt and Tl flies weresusceptible to infection with M.circinelloides 488128 while pre-exposure of conidia toVRC was associated with increased mortality (47% to 74,8% in Wt flies, P<0.001, 54% to90,8% in Tl flies, P<0.001). Exposure of R.oryzae 557969 to itraconazole, caspofungin oramphotericin B did not significantly alter their virulence in neither Wt nor Tl flies.Exposure of A.fumigatus 293 to VRC did not alter its virulence in Tl flies (57% mortality without VRC pre-exposure, 56% mortality with VRC pre-exposure, P=0.88).Immunosupressed Balb/C mice were susceptible to infection with R.oryzae557969. In both concentrations used, previous exposure of conidia to sub-inhibitoryconcentrations of VRC was associated with increased mortality. In the high-inoculum group, 10 day mortality was 67% for the mice infected with VRC-nonexposed R.oryzae557969, compared with 93% for those infected with R.oryzae 557969 pre-exposed to VRC(P<0.009). Similarly, infection with the low inoculum VRC-nonexposed was associatedwith a 10 day mortality rate of 43% that increased to 86% with previous exposure ofconidia to VRC (P<0.001).Histopathological examination at an early time point (day 4) during the course ofthe infection revealed more intense inflammatory changes, increased infiltration ofpulmonary parenchyma by polymorphonuclear leukocytes and intravascular hyphalproliferation in the lungs of the mice infected with R.oryzae 557969 pre-exposed to VRC.The median fungal burden was significantly higher in the lungs of mice infected with R.oryzae 557969 pre-exposed to VRC, compared to the lungs of mice infected with VRCnonexposedR.oryzae 557969 both in the high inoculum (2-log difference, P=0.002) aswell as the low inoculum (1-log difference, P=0.006). Microarray analysis ofinflammation associated genes revealed 71 genes the expression of which wassignificantly higher in the lungs of mice infected with VRC-exposed R.oryzae 557969. DiscussionZygomycosis has recently emerged as the second most common opportunisticmycosis among patients with hematologic malignancies and bone marrow transplantrecipients (6). Recent studies have attributed this trend to the use of VRC inprophylactic, empirical or preemptive therapy of fungal infections, creating selectivepressure favoring the emergence of drug resistant organisms as the Zygomycetes. In the present study, exposure of three different Zygomycetes isolates in subinhibitoryconcentrations of VRC increased their virulence in D.melanogaster flies. Ourfindings were specific for the Zygomycetes (exposure of A.fumigatus to VRC did not alterits virulence) and VRC (exposure of R.oryzae to other antifungals did not alter itsvirulence). Furthermore, our findings were confirmed in a murine animal model ofzygomycosis, where infection with VRC-preexposed R.oryzae conidia was associatedwith increased mortality, increased fungal burden in mice lungs and increasedexpression of genes associated with the development of inflammatory response.In conclusion, our findings in two different animal models of zygomycosisconfirm our original hypothesis that exposure of Zygomycetes to sub-inhibitoryconcentrations of VRC increases their virulence. This study suggests an alternativeexplanation to the increasing incidence of zygomycosis in immunocompromisedpatients receiving VRC. Given the poor outcome of this opportunistic mycosis, themechanisms underlying the modulation of Zygomycetes virulence should be furtherexplored.Οι διηθητικές μηκυτιακές λοιμώξεις αποτελούν μείζονα αιτία θνησιμότητας και θνητότητας σε ανοσοκατεσταλμένους ασθενείς και λήπτες μοσχεύματος μυελού των οστών (1). Η αυξανόμενη επίπτωσή τους, έχει οδηγήσει στην χρήση της βορικοναζόλης(VRC) σαν προφυλακτική αγωγή σε ασθενείς υψηλού κινδύνου για την εκδήλωση μηκυτιακών λοιμώξεων (2). Παρά το ευρύ φάσμα δράσης, η VRC είναι ανενεργή απέναντι στους ζυγομήκυτες (3), οι οποίοι ευθύνονται για έναν αυξανόμενο αριθμό λοιμώξεων στους συγκεκριμένους ασθενείς (1, 4). Πρόσφατες μελέτες συσχετίζουν την αύξηση της επίπτωσης της ζυγομηκυτίασης με τη χρήση της VRC ως προφυλακτικής αγωγής (1,2, 5-9). Δεδομένου του σύνθετου μηχανισμού παθογονικότητας των ζυγομυκήτων, δεν είναι σαφές αν η αγωγή με VRC ευνοεί την ανάπτυξη των ζυγομυκήτων ως πίεση φυσικής επιλογής ή ευθέως επιδρώντας στην παθογονικότητά τους. Για τη διερεύνηση της επίδρασης της έκθεσης σε VRC στην παθογονικότητα των ζυγομυκήτων, χρησιμοποιήσαμε ως μοντέλο ξενιστή την μύγα Drosophila melanogaster(10-12). Προκειμένου να επαληθεύσουμε τα αρχικά μας ευρήματα σε έναν οργανισμό φυλογενετικά συγγενέστερο προς τον άνθρωπο, χρησιμοποιήσαμε ένα ζωικό μοντέλο ζυγομηκυτίασης σε θηλαστικά, με ποντικούς Balb/C. Yλικά και μέθοδοι. Xρησιμοποιήθηκαν 3 στελέχη ζυγομυκήτων (Rhizopus oryzae 557969, Rhizopusoryzae 518749 και Mucor circinelloides 48812) και ως μάρτυρα ένα στέλεχος Ασπεργίλλου(Aspergillus fumigatus 293), κονίδια των οποίων εκτέθηκαν σε VRC, ιτρακοναζόλη, κασποφουγκίνη ή αμφοτερικίνη Β με διαδοχικές καλλιέργειες σε μέσο που περιείχε μια υποανασταλτική συγκέντρωση του κάθε φαρμάκου (13). Ώς μάρτυρες, τα ίδια στελέχη επωάστηκαν διαδοχικές φορές σε μέσο χωρίς αντιμηκυτιακό. Για το ζωικό μοντέλο ζυγομηκυτίασης σε μύγες D.melanogaster, χρησιμοποιήσαμε μύγες αγρίου τύπου OregonR (Wt) καθώς και γενετικά τροποποιημένες μύγες απο τις οποίες απουσιάζει το μονοπάτι Τοll (Tl), το οποίο προστατεύει τις μύγες Wt απο την πλειοψηφία των μηκυτιακών παθογόνων, αλλά όχι τους ζυγομήκυτες (12,13). Η μόλυνση πραγματοποιήθηκε με τρώση του θώρακα των μυγών με βελόνη πρότινοςεμβυθισμένη σε διάλυμα κονιδίων (106 κονίδια/ml)(12, 13). Η επιβίωση κατεγράφη για χρονικό διάστημα 8 ημερών μετά τη μόλυνση. Για το ζωικό μοντέλο ζυγομηκυτίασης σε θηλαστικά, χρησιμοποιήσαμε ποντικούς Balb/C, ανοσοκατεσταλμένους με τη χρήση κορτιζόνης (14). Η μόλυνση πραγματοποιήθηκε με ενδορινική ενστάλλαξη διαλύματος κονιδίων του στελέχους R.οryzae 557969 δύο διαφορετικών συγκεντρώσεων (5x104 κονίδια/ml και 106 κονίδια/ml) και η επιβίωση παρατηρήθηκε για 10 ημέρες.Για την ιστοπαθολογική ανάλυση χρησιμοποιήθηκαν πνεύμονες ποντικών απο κάθε πειραματική ομάδα που παρασκευάστηκαν διαδοχικές ημέρες μετά απο τη μόλυνση, ενώ η χρώση των δειγμάτων έγινε με η ωσίνη-αιματοξυλίνη, χρώση αργύρου Grocott-Gomori methenamine silver nitrate) και χρώση ιώδους της κρεσύλης (cresylviolet). Για την ανάλυση του μηκυτιακού φορτίου, χρησιμοποιήθηκε η ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (qPCR) με δεοξυριβονουκλεϊκό οξύ (DNA) R.οryzaeπου απομονώθηκε απο πνεύμονες μολυσμένων ποντικών. Για την μελέτη της μεταβολής στην έκφραση γονιδίων των ποντικών που σχετίζονται με την ανάπτυξη ανοσολογικής αντίδρασης μετά τη μόλυνση, απομονώθηκε ριβονουκλεϊκό οξύ (RNA) απο τους πνεύμονες υγιών ποντικών καθώς και ποντικών που είχαν μολυνθεί με κονίδια R.οryzae(με ή χωρίς προηγούμενη έκθεση σε VRC) το οποίο και χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση με τη μέθοδο των μικροσυστοιχιών (micro-arrays).Οι καμπύλες επιβίωσης για τις μύγες και τα ποντίκια επεξεργάστηκαν με ανάλυση Kaplan Meier και log rank test, προκειμένου να διερευνηθεί η ύπαρξη διαφορών μεταξύ των μαρτύρων (μύγες ή ποντίκια που μολύνθηκαν με μύκητες που δεν είχαν εκτεθεί σε αντιμηκυτιασικά) και των μυγών ή ποντικών αντίστοιχα που μολύνθηκαν με μήκυτες πρότινος εκτεθειμένους σε αντιμηκυτιακά. Η σύγκριση του μηκυτιακού φορτίου στους πνεύμονες διαφορετικών ομάδων ποντικών πραγματοποιήθηκε με ανάλυση Mann-Whitney U test. Η μελέτη της γονιδιακής έκφρασης στις διαφορετικές ομάδες ποντικών πραγματοποιήθηκε με ανάλυση unpairedstudent t test και τη μέθοδο Benjamini-Hochberg. Οι διαφορές μεταξύ των πειραματικών ομάδων θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές όπου P < 0,05. Αποτελέσματα. Η μόλυνση μυγών Wt με R.oryzae 557969 οδήγησε στην εκδήλωση οξείας λοίμωξης με 39% θνητότητα, ενώ προηγούμενη έκθεση των κονιδίων σε VRC αύξησε τη θνητότητα σε 65% (P<0,001). Μόλυνση μυγών Tl με το ίδιο στέλεχος είχε ως αποτέλεσμα θνητότητα 54% (82% με προηγούμενη έκθεση σε VRC, P<0,001). Μόλυνση μυγών Wt με το στέλεχος R.oryzae 518749, είχε 64% θνητότητα, που αυξήθηκε σε 80% αν το κονίδια είχαν προηγουμένως εκτεθεί σε VRC (P=0,03). Μόλυνση μυγών Tl με το ίδιο στέλεχος είχε 81% θνητότητα (95% με προηγούμενη έκθεση σε VRC, P<0,001). Παρομοίως, οι μύγες Wt και Tl ήταν ευαίσθητες στην μόλυνση με το στέλεχος M.circinelloides 488128 ενώ έκθεση των κονιδίων σε VRC αύξησε τη θνητότητα (απο 47% σε 75% στις Wt,P<0,001, απο 54% σε 90,8% στις Tl, P<0,001). Η έκθεση κονιδίων R.oryzae 557969 σε ιτρακοναζόλη, κασποφουγκίνη ή αμφοτερικίνη Β δεν επηρέασε στατιστικώς σημαντικάτην παθογονικότητά του ούτε στις μύγες Wt αλλά ούτε και στις μύγες Tl. Εξάλλου, η έκθεση A. fumigatus 293 σε VRC δεν φάνηκε να έχει επίδραση στην παθογονικότητά του. Συγκεκριμένα, μόλυνση μυγών Tl με κονίδια A. fumigatus 293 είχε ως αποτέλεσμα θνητότητα 57% (56% με προηγούμενη έκθεση του στελέχους σε VRC, P=0,88).Οι ποντικοί Balb-C ήταν ευαίσθητοι στη μόλυνση με διάλυμα κονιδίων R. oryzae557969. Η παρατηρούμενη θνητότητα και στις δύο συγκεντρώσεις που χρησιμοποιήθηκαν για τη μόλυνση ήταν μεγαλύτερη αν τα κονίδια είχαν εκτεθεί σεVRC. ΢την ομάδα που μολύνθηκε με το διάλυμα υψηλής συγκέντρωσης κονιδίων, η θνητότητα ήταν 67%, ενώ προηγούμενη έκθεση των κονιδίων σε VRC είχε ως αποτέλεσμα την αύξηση της θνητότητας σε 93% (P< 0,009). Παρομοίως, μόλυνση με την μικρότερη συγκέντρωση είχε 43% θνητότητα, που αυξήθηκε σε 86%, αν τα κονίδια είχαν εκτεθεί σε VRC (P< 0,001).Η ιστοπαθολογική εξέταση πνευμόνων ποντικών τέσσερις ημέρες μετά την μόλυνση αποκάλυψε την εμφάνιση εντονότερης φλεγμονώδους αντίδρασης, με εκτεταμένη διήθηση του πνευμονικού παρεγχύματος απο ουδετερόφιλα πολυμορφοπύρηνα και διήθηση των αγγείων απο μηκυτιακές υφές όταν τα κονίδια είχαν πρότινος εκτεθεί σε VRC. Σο μέσο μηκυτιακό φορτίο ήταν αυξημένο στους πνεύμονες ποντικών που είχαν μολυνθεί με κονίδια τα οποία είχαν εκτεθεί σε VRC σεσχέση με τους πνεύμονες ποντικών που είχαν μολυνθεί με κονίδια τα οποία δεν είχαν εκτεθεί σε VRC (διαφορά ενός λογαρίθμου με χρήση διαλύματος χαμηλής συγκέντρωσης κονιδίων, P=0,006, διαφορά δύο λογαρίθμων με χρήση διαλύματος υψηλής συγκέντρωσης, P=0,002). H ανάλυση της έκφρασης γονιδίων που σχετίζονται με την ανάπτυξη ανοσολογικής απάντησης στους ποντικούς με χρήση μικροσυστοιχειών εντόπισε 71 γονίδια που η έκφρασή τους αυξήθηκε επιπλέον όταν τα κονίδια είχαν εκτεθεί σε VRC πριν τη μόλυνση. ΣυζήτησηΗ ζυγομηκυτίαση έχει εξελιχθεί στην δεύτερη σε συχνότητα μηκυτιακή λοίμωξη από υφομήκυτες σε ανοσοκατεσταλμένους ασθενείς (6). Πρόσφατες μελέτες αποδίδουν την αύξηση της επίπτωσης της νόσου στην προφυλακτική χρήση δραστικών απέναντι στον Ασπέργιλλο αντιμηκυτιακών, τα οποία δημιουργούν μια πίεση επιλογής που ευνοεί την ανάπτυξη ανθεκτικών οργανισμών όπως οι ζυγομήκυτες (2, 5, 6).΢την παρούσα μελέτη, η έκθεση τριών διαφορετικών στελεχών ζυγομηκύτων σε υποανασταλτικές συγκεντρώσεις VRC αύξησε την παθογονικότητά τους στις μύγεςD.melanogaster. Η παρατήρησή μας ήταν ειδική για τους ζυγομήκυτες (έκθεσηΑσπεργίλλου σε VRC δεν μετέβαλε την παθογονικότητά του) αλλά και για την VRC(έκθεση R.oryzae σε άλλα αντιμηκυτιασικά δεν είχε επίδραση στην παθογονικότητά του). Σα ευρήματά μας επαληθεύτηκαν και σε ένα ζωικό μοντέλο πνευμονικής ζυγομηκυτίασης, όπου μόλυνση με κονίδια που είχαν πρότινος εκτεθεί σε VRC είχε ως αποτέλεσμα την εκδήλωση λοίμωξης με αυξημένη θνητότητα, αυξημένο μηκυτιακόφορτίο στους πνεύμονες καθώς και αύξηση της έκφρασης γονιδίων που σχετίζονται με την ανάπτυξη ανοσολογικής αντίδρασης. Συνοψίζοντας, τα ευρήματά μας σε δύο ζωικά μοντέλα ζυγομηκυτίασης επιβεβαιώνουν την αρχική μας υπόθεση πως η έκθεση ζυγομηκύτων σε υποανασταλτικές συγκεντρώσεις VRC αυξάνει την παθογονικότητά τους. Σε αυτό το πλαίσιο, η ανά χείρας μελέτη προτείνει μια εναλλακτική εξήγηση για την αυξανόμενη συχνότητα εμφάνισης ζυγομηκυτίασης σε ανοσοκατεσταλμένους ασθενείς υπό προφυλακτική αγωγή με VRC, όπως αυτή έχει παρατηρηθεί τα τελευταία χρόνια.Δεδομένης της υψηλής θνησιμότητας και θνητότητας που χαρακτηρίζει την διηθητική ζυγομηκυτίαση, ο μηχανισμός μέσω του οποίου η έκθεση σε VRC αυξάνει την παθογονικότητα των ζυγομηκύτων αποτελεί σημαντική κατεύθυνση για μελλοντικές ερευνητικές προσπάθειε