Plant Hsp90 Proteins Interact with B-Cells and Stimulate Their Proliferation

. incubation of spleen cells with rpHsp90 led to the expansion of CD19-bearing populations, suggesting a direct effect of these proteins on B lymphocytes. This effect was confirmed by immunofluorescence analysis, where a direct binding of rpHsp90 to B- but not to T-cells was observed in cells from BALB/c and C3H/HeN mice. Finally, we examined the involvement of Toll Like Receptor 4 (TLR4) molecules in the rpHsp90s induction of B-cell proliferation. Spleen cells from C3H/HeJ mice, which carry a point mutation in the cytoplasmic region of TLR4, responded poorly to prAtHsp90. However, the interaction between rpHsp90 and B-cells from C3H/HeJ mice was not altered, suggesting that the mutation on TLR4 would be affecting the signal cascade but not the rpHsp90-TLR4 receptor interaction.Our results show for the first time that spleen cell proliferation can be stimulated by a non-pathogen-derived Hsp90. Furthermore, our data provide a new example of a non-pathogen-derived ligand for TLRs

Expression of an scFv antibody fragment in Nicotiana benthamiana and in vitro assessment of its neutralizing potential against the snake venom metalloproteinase BaP1 from Bothrops asper

Human accidents with venomous snakes represent an overwhelming public health problem, mainly in rural populations of underdeveloped countries. Their high incidence and the severity of the accidents result in 81,000 to 138,000 deaths per year. The treatment is based on the administration of purified antibodies, produced by hyper immunization of animals to generate immunoglobulins (Igs), and then obtained by fractionating hyper immune plasma. The use of recombinant antibodies is an alternative to conventional treatment of snakebite envenoming, particularly the Fv fragment, named the single-chain variable fragment (scFv). We have produced recombinant single chain variable fragment scFv against the venom of the pit viper Bothrops asper at high levels expressed transiently and stably in transgenic plants and in vitro cultures that is reactive to BaP1 (a metalloproteinase from B. asper venom). The yield from stably transformed plants was significantly (p > 0.05) higher than the results in from transient expression. In addition, scFvBaP1 yields from systems derived from stable transformation were: transgenic callus 62 μg/g (±2); biomass from cell suspension cultures 83 μg/g (±0.2); culture medium from suspensions 71.75 mg/L (±6.18). The activity of scFvBaP1 was confirmed by binding and neutralization of the fibrin degradation induced by BnP1 toxins from B. neuwiedi and by Atroxlysin Ia from B. atrox venoms. In the present work, we demonstrated the potential use of plant cells to produce scFvBaP1 to be used in the future as a biotechnological alternative to horse immunization protocols to produce anti-venoms to be used in human therapy against snakebites.Fil: Gomes, Marinna. Universidade Federal de Juiz de Fora; BrasilFil: Alvarez, Maria Alejandra. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Universidad Maimónides; ArgentinaFil: Quellis, Leonardo Ramos. Universidade Federal de Juiz de Fora; BrasilFil: Laguía Becher, Melina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Universidad Maimónides; ArgentinaFil: Castro, Juciane Maria de Andrade. Universidade Federal de Juiz de Fora; BrasilFil: Gameiro, Jacy. Universidade Federal de Juiz de Fora; BrasilFil: Caporrino, Maria Cristina. Governo do Estado de Sao Paulo. Secretaria da Saude. Instituto Butantan; BrasilFil: Silva, Ana Maria Moura da. Governo do Estado de Sao Paulo. Secretaria da Saude. Instituto Butantan; BrasilFil: Santos, Marcelo de Oliveira. Universidade Federal de Juiz de Fora; Brasi

The fusion of Toxoplasma gondii SAG1 vaccine candidate to Leishmania infantum heat shock protein 83-kDa improves expression levels in tobacco chloroplasts

Chloroplast transformation technology has emerged as an alternative platform offering many advantages over nuclear transformation. SAG1 is the main surface antigen of the intracellular parasite Toxoplasma gondii and a promising candidate to produce an anti-T. gondii vaccine. The aim of this study was to investigate the expression of SAG1 using chloroplast transformation technology in tobacco plants. In order to improve expression in transplastomic plants, we also expressed the 90-kDa heat shock protein of Leishmania infantum (LiHsp83) as a carrier for the SAG1 antigen. SAG1 protein accumulation in transplastomic plants was approximately 0.1–0.2 μg per gram of fresh weight (FW). Fusion of SAG1 to LiHsp83 significantly increased the level of SAG1 accumulation in tobacco chloroplasts (by up to 500-fold). We also evaluated the functionality of the chLiHsp83-SAG1. Three human seropositive samples reacted with SAG1 expressed in transplastomic chLiHsp83-SAG1 plants. Oral immunization with chLiHsp83-SAG1 elicited a significant reduction of the cyst burden that correlated with an increase of SAG1-specific antibodies. We propose the fusion of foreign proteins to LiHsp83 as a novel strategy to increase the expression level of the recombinant proteins using chloroplast transformation technology, thus addressing one of the current challenges for this approach in antigen protein production.Fil: Albarracín, Romina Mariel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico la Plata. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas - Instituto Tecnológico Chascomús. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas (sede Chascomús); ArgentinaFil: Laguía Becher, Melina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico la Plata. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas - Instituto Tecnológico Chascomús. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas (sede Chascomús); ArgentinaFil: Farran, Inmaculada. Universidad de Navarra; EspañaFil: Sander, Valeria Analia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico la Plata. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas - Instituto Tecnológico Chascomús. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas (sede Chascomús); ArgentinaFil: Corigliano, Mariana Georgina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico la Plata. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas - Instituto Tecnológico Chascomús. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas (sede Chascomús); ArgentinaFil: Yácono, Maria L.. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico la Plata. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas - Instituto Tecnológico Chascomús. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas (sede Chascomús); ArgentinaFil: Pariani Alvarez, Sebastian Adolfo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico la Plata. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas - Instituto Tecnológico Chascomús. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas (sede Chascomús); ArgentinaFil: Sánchez López, Edwin Fernando. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico la Plata. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas - Instituto Tecnológico Chascomús. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas (sede Chascomús); ArgentinaFil: Veramendi, Jon. Universidad de Navarra; EspañaFil: Clemente, Marina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico la Plata. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas - Instituto Tecnológico Chascomús. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas (sede Chascomús); Argentin

Effect of codon optimization and subcellular targeting on Toxoplasma gondii

BACKGROUND: Codon optimization and subcellular targeting were studied with the aim to increase the expression levels of the SAG1(78-322 )antigen of Toxoplasma gondii in tobacco leaves. The expression of the tobacco-optimized and native versions of the SAG1 gene was explored by transient expression from the Agrobacterium tumefaciens binary expression vector, which allows targeting the recombinant protein to the endoplasmic reticulum (ER) and the apoplast. Finally, mice were subcutaneously and orally immunized with leaf extracts-SAG1 and the strategy of prime boost with rSAG1 expressed in Escherichia coli was used to optimize the oral immunization with leaf extracts-SAG1. RESULTS: Leaves agroinfiltrated with an unmodified SAG1 gene accumulated 5- to 10-fold more than leaves agroinfiltrated with a codon-optimized SAG1 gene. ER localization allowed the accumulation of higher levels of native SAG1. However, no significant differences were observed between the mRNA accumulations of the different versions of SAG1. Subcutaneous immunization with leaf extracts-SAG1 (SAG1) protected mice against an oral challenge with a non-lethal cyst dose, and this effect could be associated with the secretion of significant levels of IFN-γ. The protection was increased when mice were ID boosted with rSAG1 (SAG1+boost). This group elicited a significant Th1 humoral and cellular immune response characterized by high levels of IFN-γ. In an oral immunization assay, the SAG1+boost group showed a significantly lower brain cyst burden compared to the rest of the groups. CONCLUSION: Transient agroinfiltration was useful for the expression of all of the recombinant proteins tested. Our results support the usefulness of endoplasmic reticulum signal peptides in enhancing the production of recombinant proteins meant for use as vaccines. The results showed that this plant-produced protein has potential for use as vaccine and provides a potential means for protecting humans and animals against toxoplasmosis

Stable expression of the E2 protein from the bovine viral diarrhea virus in in vitro cultures from tobacco and the humoral immune response induced in cows by tobacco-agroinfiltrated leaf extracts

Nuestro objetivo fue comparar los niveles de expresión de la proteína E2 del virus de la diarrea viral bovina (VDVB), expresada mediante transformación estable o transitoria, en plantas de tabaco. Además, se determinó la capacidad de inducción de anticuerpos neutralizantes anti-E2 en ganado mediante la inmunización con una vacuna experimental formulada con extracto de hojas de tabaco agroinfiltradas que expresan transitoriamente una versión de la proteína E2 de retención en retículo endoplasmático (E2-ER). Los callos y las suspensiones celulares obtenidos luego de la transformación estable expresaron las versiones de la proteína E2 direccionada al apoplasto (E2-Apo) y de retención en retículo endoplasmático. Los niveles de expresión en callos fueron de 3 µg/g de peso fresco (PF), lo que equivale a 1,15 % de las proteínas totales solubles (PTS). Ambas versiones de la proteína recombinante, E2-Apo y E2-ER, fueron detectadas en la biomasa de las suspensiones celulares, pero en niveles muy inferiores a los obtenidos para callos. La inmunización del ganado con una vacuna experimental, conteniendo extracto de hojas de tabaco agroinfiltradas (60 µg de E2-ER) y el adyuvante Al(OH)3 Hydrogel (90:10), indujo un alto nivel de anticuerpos anti-E2, con un 87,5 % de seroconversión y un título promedio considerado inmunoprotector. Podemos concluir que los niveles de expresión de la proteína E2 en callos son significativamente mayores que los obtenidos en suspensiones celulares, pero menores que los obtenidos mediante la expresión transitoria en hojas agroinfiltradas. El ganado inmunizado con la vacuna experimental mostró una respuesta humoral fuerte, lo que predice que puede ser utilizada en el desarrollo de una vacuna a subunidades contra VDVB.Our goal was to compare transient y stable plant expression strategies for the production of the E2 protein from Bovine Viral Diarrhea Virus (BVDV) and to test the ability to induce the production of neutralizing anti-E2 antibodies in cattle from an experimental vaccine containing agroinfiltrated tobacco leaf extracts expressing the E2-ER version. Stably transformed tobacco calluses y cell suspensions expressing the apoplast-directed (E2-Apo) y endoplasmic reticulum-retained (E2-ER) E2 protein versions have been established. The E2 expression levels in calluses were similar for both versions and were estimated to be 3 µg/g fresh weight (FW), corresponding to 1.15 % of total soluble protein (TSP). The E2-Apo y E2-ER proteins were detected in the biomass of cell suspension cultures but only after sample concentration, indicating that calluses produce higher levelsof E2 than cell suspension cultures. On the other hand, immunization of cattle with an experimental vaccine constituted by an aqueous extract containing E2 transiently expressed in tobacco leaves (60 µg of E2-ER) and Al(OH)3 Hydrogel adjuvant (90:10) produced a high level of anti-E2 antibodies (87.5 % seroconversion) with titers considered to be immunoprotective. The E2 expression levels in calluses were significantly higher than those obtained in cell uspension cultures but lower than those attained by transient expression in agroinfiltrated leaves. The immunized cattle developed a strong humoral response showing the potential of the plant-made E2 protein to develop a subunit vaccine against BVDB.Fil: Laguía Becher, Melina. Universidad Maimónides. Área de Investigaciones Biomédicas y Biotecnológicas. Centro de Estudios Biomédicos, Biotecnológicos, Ambientales y de Diagnóstico; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Nelson, Guillermo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Universidad Maimónides. Área de Investigaciones Biomédicas y Biotecnológicas. Centro de Estudios Biomédicos, Biotecnológicos, Ambientales y de Diagnóstico; ArgentinaFil: Ricco, María Valeria. Universidad Maimónides. Área de Investigaciones Biomédicas y Biotecnológicas. Centro de Estudios Biomédicos, Biotecnológicos, Ambientales y de Diagnóstico; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Bari, Martín León. Universidad Maimónides. Área de Investigaciones Biomédicas y Biotecnológicas. Centro de Estudios Biomédicos, Biotecnológicos, Ambientales y de Diagnóstico; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Alvarez, Maria Alejandra. Universidad Maimonides. Facultad de Cs. de la Salud. Carreras de Farmacia y Bioquímica; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentin

Co-expressing Turnip Crinkle Virus-coat protein with the serine protease α-thrombin precursor (pFIIa) in Nicotiana benthamiana Domin

The serine protease α-thrombin (FIIa) plays a fundamental role in blood clotting. In the present report, a FIIa precursor (pFIIa) was expressed in Nicotiana benthamiana Domin. The expression construct featured the Kozak consensus sequence and the 2S2 Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. signal peptide to direct the protein into the secretory pathway (sec-pFIIa). A version carrying the KDEL endoplasmic reticulum (ER) retention signal (pFIIa-ER) was also constructed. Transient expression of pFIIa in N. benthamiana leaves was achieved by Agrobacterium tumefaciens infiltration. The influence of post-transcriptional gene silencing (PTGS) was analyzed by co-infiltrating with an A. tumefaciens strain carrying the construct for the Turnip Crinkle Virus-coat protein (TCV-CP) known for interfering with PTGS. Reverse transcription polymerase chain reaction and Western blot analyses confirmed the presence of the corresponding messenger RNA and the recombinant pFIIa protein in plant extracts. A positive effect of the addition of the PTGS inhibitor was demonstrated. The accumulation of sec-pFIIa and pFIIa-ER was estimated to be 6 μg g −1 fresh weight (FW) (0.07% (w/w) total protein concentration; TPC) and 17 μg g −1 FW (0.21% (w/w) TPC), respectively. Furthermore, stably transformed callus and suspension cultures were obtained. The recombinant protein was detected only in the biomass of the pFIIa-ER cell suspension line at a concentration of 0.25 μg mL −1 (0.017% (w/w) of total soluble protein). This appears to be the first report describing the expression of a precursor of FIIa in plants.Fil: Laguía Becher, Melina. Universidad Maimónides; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Zaldúa, Zurima. Universidad Maimónides; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Xu, Weijie. Universidad de Nebraska - Lincoln; Estados UnidosFil: Marconi, Patricia Laura. Universidad Maimónides; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Velander, William. Universidad de Nebraska - Lincoln; Estados UnidosFil: Alvarez, Maria Alejandra. Universidad Maimónides; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentin

Efficient expression of a Toxoplasma gondii dense granule Gra4 antigen in tobacco leaves

A His-tagged truncated version of Toxoplasma gondii dense granule 4 protein (Gra4163-345) was transiently expressed in tobacco leaves. Two genetic constructions were used to accomplish this goal. In one of them, based in a Potato virus X (PVX) amplicon, the sequence encoding His-Gra4163-345 was placed under control of an additional PVX coat protein subgenomic promoter. In the other, the same sequence was fused to an apoplastic transport signal and placed under the direction of the cauliflower mosaic virus 35S promoter. His-Gra4163-345 accumulation in agroinfiltrated tobacco leaves was estimated by Western blot analysis using mouse anti-Gra4 antibody and a seropositive human serum. Here, we demonstrated the feasibility of producing a Gra4 antigen using transient expression methods in plants.Fil: Ferraro, Gisela. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas "Dr. Raúl Alfonsín" (sede Chascomús). Universidad Nacional de San Martín. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas "Dr. Raúl Alfonsín" (sede Chascomús); ArgentinaFil: Laguía Becher, Melina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas "Dr. Raúl Alfonsín" (sede Chascomús). Universidad Nacional de San Martín. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas "Dr. Raúl Alfonsín" (sede Chascomús); ArgentinaFil: Ángel, Sergio Oscar. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas "Dr. Raúl Alfonsín" (sede Chascomús). Universidad Nacional de San Martín. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas "Dr. Raúl Alfonsín" (sede Chascomús); ArgentinaFil: Zelada, Alicia Mercedes. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular "Dr. Héctor N. Torres"; ArgentinaFil: Mentaberry, Alejandro Nestor. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular "Dr. Héctor N. Torres"; ArgentinaFil: Clemente, Marina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas "Dr. Raúl Alfonsín" (sede Chascomús). Universidad Nacional de San Martín. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas "Dr. Raúl Alfonsín" (sede Chascomús); Argentin

Evaluation of the antigenic value of recombinant Toxoplasma gondii HSP20 to detect specific immunoglobulin G antibodies in Toxoplasma infected humans

Recombinant Toxoplasma gondii small heat shock protein HSP20, surface antigen SAG1 and dense granule GRA7 were analyzed by IgG-ELISA with serum samples of Toxoplasma infected humans grouped as I (IgG+, IgM+), II (IgG+, IgM-) and III (IgG-, IgM-). rHSP20 reacted against 80% and 62.5% of serum samples from groups I and II, respectively. rSAG1 was recognized by 85% of the samples from group I and 70.8% from group II, whereas rGRA7 was recognized by 85% and 66.6% of the serum samples from groups I and II, respectively. When a combination of two or three recombinant antigens was used, the sensitivity values improved to 85-95% for group I and 87.5-91.7% for group II. All combinations tested produced similar reactivity profiles. None of the recombinant proteins reacted against group III serum samples. In conclusion, we demonstrated that T. gondii HSP20 elicits an important B-cell response during human infection, and could be suitable for the development of serodiagnosis tools.Fil: Cóceres, Verónica Mabel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas "Dr. Raúl Alfonsín" (sede Chascomús). Universidad Nacional de San Martín. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas "Dr. Raúl Alfonsín" (sede Chascomús); ArgentinaFil: Laguía Becher, Melina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas "Dr. Raúl Alfonsín" (sede Chascomús). Universidad Nacional de San Martín. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas "Dr. Raúl Alfonsín" (sede Chascomús); ArgentinaFil: de Napoli, Maximiliano Gabriel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas "Dr. Raúl Alfonsín" (sede Chascomús). Universidad Nacional de San Martín. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas "Dr. Raúl Alfonsín" (sede Chascomús); ArgentinaFil: Corvi, Maria Martha. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas "Dr. Raúl Alfonsín" (sede Chascomús). Universidad Nacional de San Martín. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas "Dr. Raúl Alfonsín" (sede Chascomús); ArgentinaFil: Clemente, Marina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas "Dr. Raúl Alfonsín" (sede Chascomús). Universidad Nacional de San Martín. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas "Dr. Raúl Alfonsín" (sede Chascomús); ArgentinaFil: Ángel, Sergio Oscar. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas "Dr. Raúl Alfonsín" (sede Chascomús). Universidad Nacional de San Martín. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas "Dr. Raúl Alfonsín" (sede Chascomús); Argentin

Establishment of callus-cultures of the Argentinean mistletoe, Ligaria cuneifolia (R. et P.) Tiegh (Loranthaceae) and screening of their polyphenolic content

Ligaria cuneifolia (R. et P.) Tiegh (Loranthaceae), known as liga, muérdago criollo, or Argentinean mistletoe, is a hemiparasitic plant with a broad distribution in central and northern Argentina. Pharmacological studies showed that L. cuneifolia extracts have hypolipemic, antioxidant, antibacterial, and immunomodulatory effects. We have established callus cultures from embryo and haustoria fragments. The highest frequency of callus formation from embryos (85%) was obtained on White medium with 4% (w/v) sucrose and 2.5 µM 1-naphtalene acetic acid and 9.2 µM kinetin as plant growth regulators (PGRs). From haustoria, the best result (35%) was obtained on Gamborg medium with 3% (w/v) sucrose and 0.45 µM 2,4-dichlorephenoxyacetic acid and 0.47 µM zeatin as PGRs. Thin layer chromatography showed that callus methanolic extract (2.5% w/v) had a lower content of flavonoids and proanthocyanins as compared to the wild plant (5% w/v for leaves, stems, and flowers), but a higher content of hydroxycinnamic acids. High performance liquid chromatography–tandem mass spectrometry (HPLC–MS/MS) showed the presence of quercetin glycosides and phenolic acids in the methanolic extracts both from the parent plant and the callus obtained from embryo.Fil: Ricco, María Valeria. Universidad Maimónides. Facultad de Ciencias de la Salud. Carreras de Farmacia y Bioquímica. Cátedra de Farmacobotánica y Farmacognoscia; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Bari, Martín León. Universidad Maimónides. Facultad de Ciencias de la Salud. Carreras de Farmacia y Bioquímica. Cátedra de Farmacobotánica y Farmacognoscia; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Bagnato, Federico. Universidad Maimónides. Facultad de Ciencias de la Salud. Carreras de Farmacia y Bioquímica. Cátedra de Farmacobotánica y Farmacognoscia; ArgentinaFil: Cornacchioli, Carolina. Universidad Maimónides. Facultad de Ciencias de la Salud. Carreras de Farmacia y Bioquímica. Cátedra de Farmacobotánica y Farmacognoscia; ArgentinaFil: Laguía Becher, Melina. Universidad Maimónides. Área de Investigaciones Biomédicas y Biotecnológicas. Centro de Estudios Biomédicos, Biotecnológicos, Ambientales y de Diagnóstico. Departamento de Estudios Biomédicos y Biotecnológicos; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Spairani, Leonardo Ulises. Ministerio de Relaciones Exteriores, Comercio Interno y Culto. Dirección Nacional del Antártico. Instituto Antártico Argentino; Argentina. Universidad Maimónides. Facultad de Ciencias de la Salud. Carreras de Farmacia y Bioquímica. Cátedra de Farmacobotánica y Farmacognoscia; ArgentinaFil: Posadaz, Ariana. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Universidad Nacional de San Luis. Facultad de Turismo y Urbanismo; ArgentinaFil: Dobrecky, Cecilia Beatriz. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Departamento de Tecnología Farmacéutica; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Departamento de Farmacología. Cátedra de Farmacobótanica; ArgentinaFil: Ricco, Rafael Alejandro. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Departamento de Farmacología. Cátedra de Farmacobótanica; ArgentinaFil: Wagner, Marcelo Luis. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Departamento de Farmacología. Cátedra de Farmacobótanica; ArgentinaFil: Alvarez, Maria Alejandra. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Universidad Maimónides. Facultad de Ciencias de la Salud. Carreras de Farmacia y Bioquímica. Cátedra de Farmacobotánica y Farmacognoscia; Argentin

Expression of the recombinant tE2 antigen of bovine viral diarrhea virus (BVDV) in Nicotiana tabacum plants and biosafety studies in mice

En el presente trabajo se expresaron el antígeno vacunal tE2 del virus de la diarrea viral bovina (BVDV) y la proteína marcadora de fluorescencia EGFP en forma transitoria en hojas de Nicotiana tabacum, utilizando como vector Agrobacterium tumefaciens. Analizando la supervivencia microbiana y la persistencia del RNA/proteína de EGFP pudimos estimar un riesgo ambiental hasta 6 días después de la agroinfiltración. La cinética de tiempo y el análisis de imágenes para EGFP muestran el silenciamiento de la expresión de la proteína heteróloga 6 días después de la infiltración con la cepa de Agrobacterium recombinante en las hojas de tabaco tratadas. Los extractos foliares expresando tE2 fueron clarificados y mezclados con un adyuvante oleoso o acuosos. Estos candidatos a vacunas se administraron a ratones hembra Balb/c (inoculación primaria intramuscular seguida por tres dosis de refuerzo). No se observaron diferencias significativas entre los extractos no recombinantes (tratamiento control) o extractos foliares recombinantes en el análisis clínico y bioquímico. En todos los ratones inyectados, el adyuvante provocó las lesiones patológicas clásicas observadas en los procesos inflamatorios en el sitio de inoculación. Secciones histológicas de estas lesiones y de los órganos principales no mostraron lesiones adicionales.Antigenic glycoprotein tE2 from bovine viral diarrhea virus (BVDV) and the fluorescence marker EGFP were transiently expressed in leaves of Nicotiana tabacum using Agrobacterium tumefaciens as vector. Analyzing the Agrobacterium and EGFP RNA/protein persistence allowed us to estimate an environmental exposure to recombinant material during 6 days after agroinfiltration. Time course analysis for the expression of EGFP shows silencing after 6 days post-infiltration with recombinant Agrobacterium strain in treated leaves. The leaf extracts expressing tE2 and EGFP were clarified at 6 days after agroinfiltration. The extracts were mixed with oil or aqueous adjuvants and injected to Balb/c mice in order to establish if the plant extracts are innocuous. Four doses were applied, followed by necropsy. No significant differences between non-recombinant extracts (control treatment) or recombinant leaf extracts in clinical and biochemical analysis were observed. In all mice injected, the adjuvant caused the classical pathological lesions observed in typical inflammatory processes at the site of inoculation. Histological sections of these lesions and major organs showed no further injury.Fil: Laguía Becher, Melina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Ciencia y Tecnología "Dr. César Milstein". Fundación Pablo Cassará. Instituto de Ciencia y Tecnología ; ArgentinaFil: Gallo Calderon, Marina Beatriz. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Ciencia y Tecnología "Dr. César Milstein". Fundación Pablo Cassará. Instituto de Ciencia y Tecnología ; ArgentinaFil: Rubio, Cecilia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Ciencia y Tecnología "Dr. César Milstein". Fundación Pablo Cassará. Instituto de Ciencia y Tecnología ; ArgentinaFil: Langle, Yanina Verónica. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Martinez, Sonia. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina; ArgentinaFil: San Juan, Paula. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Médica. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Médica; ArgentinaFil: Sanjuan, Norberto Aníbal. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Médica. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Médica; ArgentinaFil: Alvarez, Maria Alejandra. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Ciencia y Tecnología "Dr. César Milstein". Fundación Pablo Cassará. Instituto de Ciencia y Tecnología ; ArgentinaFil: Benavides, Maria Patricia. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Departamento de Química Biológica; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Marconi, Patricia Laura. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Ciencia y Tecnología "Dr. César Milstein". Fundación Pablo Cassará. Instituto de Ciencia y Tecnología ; Argentin