Real-time reverse transcription polymerase chain reaction

RT-qPCR is one of the most widespread and reliable methods of measuring gene expression. First, the extraction of mRNA from a homogeneous cell group is done in order to perform the RT phase (reverse transcription). At this point the reverse transcriptase enzyme synthesizes cDNA corresponding to each RNA strand. Then begins the qPCR (real time polymerase chain reaction), which gets its name because it gives quantitative results (“q” of qPCR), unlike the conventional PCR qualitative results. This stage is characterized by amplification of a specific site in the set of cDNA, which is achieved, briefly, through the use of a DNA-dependent thermostable DNA polymerase (Taq polymerase), two oligomers specific to serve as primers for polymerase and a non-specific DNA fluorophore (SYBR Green I, for example). As the double-strand cDNA is being synthesized, the fluorophore binds to its strands and, after being excited, emits light in proportion to the number of double chains. Through graphical analysis, it is possible to quantify the initial sample of cDNA that, in absence of errors, is proportional to mRNART-qPCR é um dos métodos de mensurar expressão gênica mais difundidos e confiáveis utilizados atualmente. Primeiro, realiza-se extração do RNAm de um grupo celular homogêneo para poder realizar a fase RT (transcrição reversa). Neste momento a enzima transcriptase reversa sintetiza o DNAc correspondente de cada fita de RNA. Em seguida inicia-se a qPCR (reação em cadeia da polimerase em tempo real), que recebe esse nome por dar resultados quantitativos (“q” de qPCR), diferentemente dos qualitativos da PCR convencional. Essa etapa caracteriza-se pela amplificação de um sítio específico no conjunto de DNAc, que ocorre, resumidamente, por meio do uso de uma DNA polimerase DNA-dependente termoestável (Taq polimerase), dois oligômeros específicos para servirem de iniciadores para a polimerase (primers) e um fluoróforo não específico de DNA (SYBR Green I, por exemplo). Conforme as cadeias duplas do DNAc-alvo vão sendo sintetizadas, o fluoróforo se liga a elas e, após ser excitado, emite luz proporcionalmente ao número de cadeias duplas. Através de análise gráfica pode-se quantificar a amostra inicial de DNAc que, na ausência de erros, é proporcional a de RNA

Fetal wound healing

Fetal skin repair has attracted attention of many researchers. The fetal wound healing is unique because fetal skin wounds are repaired rapidly and without scarring. In this review, a study was conducted concerning the healing process in fetal skin compared to the repair after birth. The physiological response to skin lesions after birth is scarring. In comparison fetuses in early stages of gestation respond to the same degree of damage with complete regeneration of the skin. To explain the different outcome, several factors such as increased production of collagen III by fetal fibroblasts and the increased presence of this type of collagen in the skins of fetuses have been considered. The increased amount of hyaluronic acid in the fetal matrix is correlated to the greater capacity of migration of fibroblasts in scarless repair. Myofibroblasts arise in the wound over the 24th week of pregnancy when scars begin to be formed. In addition, there is an increase in the amount of adhesion molecules in the scarless repair, which would enhance cell adhesion and migration. Lower levels of fetal wounds bTGF1 can be correlated to the reduced amount of type I collagen and may be the result of higher relative expression of bTGF3, which down regulate bTGF1. Hypoxic environment of the fetus wound and the increased amount of fetal Dot blood cells can be claimed to explain the difference in the repair process. Distinct gene expressions guide these responses and may also help elucidate the scarless fetal skin regenerationA reparação cutânea fetal tem atraído atenção de muitos pesquisadores. A cura da ferida no feto é única, pois feridas da pele fetal reparam-se rapidamente sem formação de cicatrizes. Conduzimos, neste estudo, uma revisão da literatura referente ao processo de reparo cutâneo da pele fetal comparando-o ao reparo após o nascimento. A resposta fisiológica às lesões cutâneas, ocorridas no período pós-natal, é a reparação do tegumento o que pode resultar na formação de tecido cicatricial. Entretanto, fetos em fase precoce de gestação respondem à mesma situação com regeneração completa da pele. Para explicar essa diferença, vários fatores, como produção aumentada de colágeno III por fibroblastos fetais e maior presença desse tipo de colágeno nas peles desses fetos têm sido considerados. O aumento do ácido hialurônico na matriz fetal correlaciona-se à capacidade de migração dos fibroblastos na reparação sem cicatriz. Miofibroblastos surgem na ferida fetal somente a partir do momento da gestação em que se formam cicatrizes. Além disso, observou-se o aumento na quantidade de moléculas de adesão na reparação sem cicatriz, o que aumentaria adesão e migração celular. Menores níveis de bTGF1 nas feridas fetais são correlacionados à diminuição na quantidade de colágeno I e podem ser resultado de maior expressão relativa de bTGF3, que inibe o bTGF1. Tem sido demonstrado que o ambiente hipóxico na ferida fetal conjuntamente com aumento das células Dot sanguíneas, podem estar relacionados à diferença no reparo. Expressões gênicas distintas guiam essas diferentes respostas e também podem ajudar a elucidar a regeneração cutânea feta

Lower limb ulcers in diabetic patients: molecular and cellular mechanisms

Diabetes mellitus representa um grupo de desordens metabólicas heterogêneas que surge como resultado de hiperglicemia por déficit na secreção e/ou ação da insulina. Sua prevalência e gastos relacionados vêm crescendo no mundo todo. Entre suas complicações de longo prazo, a que mais gera admissões hospitalares é a úlcera de membros inferiores. Estas feridas frequentemente tornam-se crônicas devido a uma série de aberrações moleculares e celulares do processo de cicatrização, sendo as principais: alta concentração de metaloproteinases (MMPs), neuropatia, alta probabilidade de infecção e resposta inflamatória não fisiológica, estresse oxidativo, formação excessiva de AGEs (produtos de glicoxidação avançada), neoangiogênese deficiente, desbalanço entre metabolismo e entrega de nutrientes, concentrações inadequadas de fatores de crescimento e reguladores de expressão gênica, e anormalidades celulares. Com melhor compreensão científica desses eventos e da cicatrização fisiológica, novas abordagens da patologia poderão fornecer resultados mais satisfatórios ao seu tratamentoDiabetes depictures a heterogeneous group of metabolic disorders that arise as a result of hyperglycemia due to the deficit of secretion and/or insulin action. Its prevalence and related costs have been growing around the world. Among its long-term complications, foot ulcer is the one that generates more hospital admissions. These wounds often become chronic due to a series of molecular and cellular aberrations of the healing process, being the main mechanisms the following: high concentrations of matrix metalloproteinases (MMPs), neuropathy, high probability of infection and non-physiological inflammatory response, oxidative stress, excessive formation of AGEs (advanced glicoxidation end-products), deficient neoangiogenesis, imbalance between metabolism and nutrient delivery, inadequate concentrations of growth factors and gene expression regulators, and cellular abnormalities. With better scientific understanding of these events and physiological healing, new approaches to disease can provide more satisfactory results to the treatmen

Venous ulcer in lower extremities

The lower limbs chronic venous ulcers are extremely stressful for patients and their families due to the physical limitation and the need of special care caused by that disease, which is responsible for the decrease of their life quality and productivity. Despite being a common problem in health care units, venous ulcers do not have adequate treatment in most of these specialized services mainly because of the ignorance of pathophysiology and therapists. Among the complex therapeutic measures described in the literature, prevention and early diagnosis are the primary steps of a proper treatment; minimizing, thus, the physical and psychological consequences brought to lower limb ulcerationsA úlcera venosa crônica de membros inferiores é extremamente desgastante para o paciente e familiares, deteriorando a qualidade de vida e a produtividade das pessoas. Apesar de ser um problema comum nas unidades de saúde, as úlceras venosas não possuem tratamento adequado na maioria dos serviços devido principalmente ao desconhecimento de sua fisiopatologia e dos métodos terapêticos. Entre as medidas terapêuticas complexas descrita na literatura, a prevenção e o diagnóstico precoce são as etapas primordiais para o tratamento adequado desses pacientes, minimizando as sequelas físicas e psicológicas de uma lesão ulcerada em membros inferiore

Physiological wound healing

O ser humano possui três interfaces de contato com o meio ambiente: as mucosas do trato gastrointestinal, do trato pulmonar e a pele. Esta, por sua vez, está sujeita a diferentes tipos de estímulos danosos, os quais desencadeiam diversas vias biológicas que tentarão restaurar as funções perdidas. O conjunto dessas vias recebe o nome de processo de cicatrização, podendo ser dividido em três fases: inflamatória, proliferativa e remodeladora. A primeira é caracterizada pela hemostasia, resultante da formação do coágulo de fibrina, e migração de leucócitos fagocitários, os quais removerão as substâncias estranhas e micro-organismos. A segunda envolve, principalmente, a migração e proliferação de três classes celulares: fibroblastos, endotélio e queratinócitos, além da deposição de fibronectina sobre o arcabouço de fibrina, formando o fibronexus; da secreção de colágeno III, em sua maioria, sobre este último e da síntese de outros elementos matriciais, sendo o fibroblasto o maior responsável por estas mudanças estruturais. Na terceira e última fase ocorre mudança no padrão de organização do colágeno e de seu tipo principal, ocorrendo substituição de colágeno III por I, aumento no número de ligações cruzadas entre os monômeros desta substância e orientação prevalente nas linhas de stress da pele, fenômenos que aumentam a resistência da ferida. Todo o processo de cicatrização será controlado por polipeptídeos chamados fatores de crescimento, que modificarão a fisiologia de suas células-alvo.The human Being has three interfaces with the environment: the mucous membranes of the gastrointestinal tract, pulmonary tract and the skin. The skin can be exposed to different damaging stimuli, which trigger various biological pathways that will attempt to restore normal physiology. This group of pathways is called wound healing process, which can be divided in three phases: inflammatory, proliferative and remodeling. The first is characterized by homeostasis, the formation of fibrin clot, and migration of phagocytic leukocytes, which will remove foreign substances and micro-organisms. The second involves primarily the migration and proliferation of three classes of cells: fibroblasts, keratinocytes and endothelium, in addition to the deposition of fibronectin on the fibrin scaffold, forming the fibronexus, the secretion of collagen III, and the synthesis of other matrix elements. The fibroblast is largely responsible for these structural changes. The third and last phase changes occur in the pattern of collagen organization and its leading brand, with replacement of collagen III by I, increase in the number of crosslinks between monomers of this substance and orientation prevalent in the lines of skin stress, phenomena that increase the resistance of the wound. The whole healing process is controlled by polypeptides called growth factors, which modify the physiology of their target cell

Cultivo de células-tronco derivadas de tecido adiposo: uma análise crítica

Introduction: adipose-derived stem cells (ADSCs) are pluripotent and present little invasive collection and high cell yield in culture, besides the fact that the number of liposuctions, the main source of these cells, is increasing around the world. Plastic Surgery has found the benefits of the use of those cells in several areas, which increases the importance of critically analyzing the protocols currently used for cell cultivation. Objective: to describe in detail the cultivation protocol adopted by our laboratory in order to perform a critical analysis of the culture of ADSCs. Method: surpluses of adipose tissue were donated to the laboratory with research purposes for 5 patients of both genders and age between 20 and 45 years. From each patient, 30 mL of fatty material was collected in a sterile flask and transported to the laboratory for cell culture, where they were subjected during 45 min to enzymatic digestion by 30 mg of type IA collagenase diluted in 30mL of Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) and then centrifuged to isolate the cells from the extracellular matrix. The amplification of the cultures was made with 0.05% trypsin solution + EDTA 0.02%. For cryopreservation was used freezing media consisting of 60% DMEM, 10% dimethylsulfoxide (DMSO) and 30% FBS. Results: The above protocol for growing ADSCs obtained a satisfactory cell culture, completing three cell passages in all samples, with subsequent freezing and thawing. Conclusions: The scientific literature indicates that collagenase get the best results in the extraction and isolation of ADSCs, paying attention to the type used. Regarding freezing, given the cytotoxicity of DMSO, new protocols with large samples replacing this cryoprotectant by trehalose should be tested, since the latter has produced good results and showed no toxic effects in published studies.Introdução: células-tronco derivadas de tecido adiposo (ADSCs) são pluripotentes, tem coleta pouco invasiva e apresentam alto rendimento celular em cultura, além do fato de o número de lipoaspirações, a principal fonte destas células, estar aumentando ao redor do mundo. A Cirurgia Plástica tem encontrado benefícios de seu uso em diversas áreas, o que ressalta a importância de se analisar criticamente os protocolos de cultivo atualmente utilizados. Objetivo: descrever detalhadamente o protocolo de cultivo adotado pelo nosso laboratório para podermos realizar uma análise crítica sobre o cultivo de ADSCs. Método: excedentes de tecido adiposo foram doados ao laboratório com finalidade de pesquisa por cinco pacientes de ambos os sexos e faixa etária de 20 a 45 anos. De cada paciente, 30 mL do material gorduroso foram coletados em frasco estéril e transportados ao laboratório de cultura celular, onde foram submetidos, por 45 min, à digestão enzimática por 30 mg de colagenase tipo IA diluída em 30mL de meio de Dulbecco Modificado por Eagle (DMEM) e posteriormente centrifugados para que se isolem as células da matriz extracelular. A amplificação das culturas foi feita com solução de tripsina 0,05% + EDTA 0,02%. Para congelamento, utilizou-se meio de congelamento composto por 60% DMEM, 10% dimetilsulfóxido (DMSO) e 30% SBF. Resultados: o protocolo apresentado para o cultivo de ADSCs demonstrou um cultivo celular satisfatório, completando três passagens de cultura em todas as amostras, com posterior congelamento e descongelamento. Conclusões: a literatura científica nos indica que a colagenase possibilita extração e isolamento de ADSCs, devendo-se atentar ao tipo utilizado. Quanto ao congelamento, dado a citotoxicidade do DMSO, novos protocolos com grandes amostras substituindo este crioprotetor por trealose devem ser testados, visto que este último produziu bons resultados e não apresentou efeitos tóxicos nos estudos já publicado

Uso da estereofotogrametria nas deformidades craniofaciais: revisão sistemática

O desenvolvimento de modelos tridimensionais digitais da face foi uma das formas de contornar as limitações dos métodos tradicionais de avaliação de tecidos moles. Para tanto, o método com maior aplicabilidade clínica atualmente é a estereofotogrametria digital. Esta revisão sistemática objetiva abordar o uso dessa técnica em anormalidades craniofaciais, com foco em sua aplicação prática. Foram realizadas buscas sobre o tema nas bases de dados Medline, Cochrane Library, LILACS e SciELO. A partir de critérios de inclusão preestabelecidos, 19 artigos foram selecionados. Extraíram-se dados sobre: sistemas utilizados, ano de publicação, doenças abordadas, pontos de referência usados para cada doença, vantagens e desvantagens da estereofotogrametria por sistema utilizado e qualidade dos artigos. O sistema 3dMD® foi o equipamento empregado em 11 artigos. O ano de publicação mais frequente foi 2010, com 6 trabalhos. Doze estudos abordaram fissuras labiopalatinas e 17 trabalhos utilizaram pontos de referência antropométricos. O caráter não-invasivo, a rápida aquisição de imagens e a acurácia foram as vantagens referidas em 70% dos artigos que aplicaram o sistema 3dMD®. A desvantagem desse mesmo equipamento apontada com maior frequência foi o alto custo. Doze artigos possuíam bom nível de evidência científica. A estereofotogrametria digital é uma tecnologia capaz de aperfeiçoar o modo de avaliação dos tratamentos e quantificação das deformidades craniofaciais. Entretanto, há necessidade de realização de mais estudos com acompanhamento a longo prazo e associação de maior variedade de sistemas

Geografia e naturaleza : experiências e abordagens de pesquisas

O texto apresenta propostas metodológicas e/ou estudos que envolvem o tema Natureza, desenvolvidos por pesquisadores vinculados à Universidade Federal da Grande Dourados e à Universidade de Campinas. A concepção de Natureza reflete e refere-se a uma categoria que permite expor as experiências dos pesquisadores dessas duas instituições, geograficamente tão distantes, com realidades muito diferentes, mas que apresentam um conhecimento geográfico convergente no que diz respeito à busca do entendimento da relação homem-natureza e a espacialidade dos fenômenos sociais e naturais advindos disso. Não obstante, esse livro reflete o pensamento de gerações de geógrafos diferentes, com formações diversas, que foram capazes de dialogar entre si para buscar elementos que os unisse no campo da Geografia

Núcleos de Ensino da Unesp: artigos 2007

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq