Construction of genomic library of rice using a bacteriophage lambda vector (Agricultural Chemistry)

バクテリオファージラムダベクターEMBL 3を用いた遺伝子ライブラリーの作製法を植物のDNAに対して効率が上がるように改変した。核DANはイネ胚芽より調製したが, 制限酵素の基質とするためには, セシウムクロライド平衡密度勾配遠心で精製する必要があった。単離したDNAはMbo Iで部分分解し, 主にFrischaufら(J. Mol. Biol. 170 827 (1983))の方法により, バクテリオファージラムダベクターEMBL 3アームと結合した。バクテリオファージDNAとイネ胚芽DNAの結合効率は, ポリエチレングリコール(PEG)6000の添加で上昇した。更に, PEG6000はin vitroパッケージングの効率も上げた。結合反応とパッケージングに対するこの改良された方法は, 植物の遺伝子ライブラリー作製に一般的に適用することが可能であろう。The method for construction of genomic library using a bacteriophage lambda vector EMBL 3 was modified so as to increase its efficiency for plant DNA. Genomic DNA was prepared from rice embryos, but to be a substrate of a restriction enzyme it had to be purified by equilibrium centrifugation in a cesium chloride density gradient. The isolated DNA was partially digested with Mbo I, then ligated with bacteriophage lambda vector EMBL 3 arms substantially according to Frischauf et al. (J. Mol. Biol. 170,827 (1983)). The efficiency for ligation between the bacteriophage DNA and the rice embryo DNA was improved by addition of polyethylen glycol (PEG) 6000. Moreover the use of PEG 6000 raised the efficiency of in vitro packaging. This improved procedure for the ligation and packaging of the recombinant DNA will be generally applicable to the construction of plant genomic libraries

菌類の構成糖に関する生化学的研究 II : ねながのひとよたけの子実体発育時の構成糖に変化について(農芸化学部門)

ねながのひとよたけCoprinus cinereusの子実体成長時の糖質の変化を検討した。遊離のglucoseはStalkではStalkの急伸長に先立って, Capでは少しおくれて増加しする。多糖については, StalkではCapの自己隔解がはじまる段階までglucanが増加しつづけ, chitinは胞子の成熟期迄増加するが以後減少する。Capではglucanもchitinも減少の一途をたどる。The changes of carbohydrates were studied during fruiting of mushroom Coprinus cinereus. Glucan and chitin contents were markediy reduced in the cap, and increased temporarily in the stalk during the development of fruit body. The stalk had a high level of glucan content particulary at the stage of maximum elongation

菌類の構成糖に関する生化学的研究 III : Rhizopus delemar および Russula pseudodelica の chitin について(農芸化学部門)

Rhizopus delemar はその菌糸中のchitin含有量が培養中菌糸の増殖と共に徐々に増加する培養4∿7日頃より菌糸の総重量(乾燥重量)は減少しはじめ, それと共にchitin総量の増加率が低下する。V-8 juice を培養基として用いた場合, chitin 総量は対照に比し24倍にも増加した。Rhizopus delemar からは純粋な chitosan が分離出来たが Russula pseudodelica の子実体からの chitosan 分画は糖蛋白様物質の除去が困難であり, これらの事からchitinの存在状態の多様性がうかがえる。The chitin content of developing mycerium of Rhizopus delemar was increased gradually and the total dry weight of the mycerium reached a maximum after one week of culture. A 24-fold increase in the total weight of chitin in the mycerium was achieved by using the V-8 juice culture medium. The pure chitosan was separated from the mycelium of Rhizopus delemar, not from the fruit body of Russula pseudodelica

植物種子の中性ジオール脂質(農芸化学部門)

微量脂質成分として, 中性ジオール脂質, 特にジアシルジオール脂質が, 種々の植物種子に普遍的に存在することを証明するため本研究を行なった。Coix属植物, オオムギ, コムギ, ベニバナ, ヒマワリ, ナタネなど, 分析した全植物(双子葉類, 単子葉類を含む)種子にジオール脂質の存在を認めた。ジオール成分としては, 1,2-エタンジオール, 1,2-および1,3-プロパンジオール, 1,3-, 1,4-, および2,3-ブタンジオール, その他が検出された。中でも1,3-プロパンジオールが最も普遍的に, かつ比較的多量に存在しており, ついで1,2-プロパンジオール, 1,2-エタンジオールが多かった。これらのジオール脂質は一般に未成熟種子に多く, 種子の成熟とともに次第にその含有比率が低下する傾向を示した。ジアシルジオール脂質の単離を目的として, 尿素付加法とクロマトグラフィーを併用する新分離法を試み, 多量の共存トリグリセリドを除去することに成功した。また直鎖型ジアシルジオール脂質の定性にNMRスペクトルを利用することを考案した。さらに, このジアシルジオール脂質は, ゴマ油やナタネ油などの一般植物油脂中にも微量含まれていることが明らかとなった。また両油脂について, トリグリセリドとジアシルジオール脂質両者の構成脂肪酸組成の比較を行なった。Very small amounts of diacyl diol lipids were widely detected in the seeds of the plants including Monocotyledoneae and Dicotyledoneae, e. g., Coix, barley, wheat, safflower, sunflower, and repeseed. The diol components of the seed lipids were 1,2-ethanediol, 1,2- and 1,3-propanediols, and 1,3-, 1,4-, and 2,3-butanediols, of which 1,3-propanediol was the most predominant. The diacyl diol lipids were present in immatureseed lipids in a higher proportion, which decreased with proceeding maturation. A new method involving urea adduct purification and magnesium oxide chromatography was successfully applied for isolating the diol lipids. NMR spectra were useful to differentiate between straight-chain diacyl diol lipids and triglycerides. Sesame oil and rapeseed oil also contained a small proportion of diacyl diol lipids : the fatty acid composition was compared with that of triglycerides from the same source

菌類の構成糖に関する生化学的研究 I : ガスクロマトグラフィーによる構成糖の検討(農芸化学部門)

ガスクロマトグラフイーでBasidiomycetes 6種とAscomycetes 1種の子実体の構成糖を検討した。子実体よりえた糖類は加水分解し, 分離したアミノ糖はまずホルマリン処理をおこなってアミノ基をblockした後, 常法通りTMS化する。4種の2-amino-2-deoxy-D-hexosesがよく分離することを確認し, ついでこの方法により子実体中に普遍的に2-amino-2-deoxy-D-glucoseが存在することを明らかにした。Phylloporus rhodoxanthusは"ひだ"を有するにかかわらず, ひだ系のPaxillusよりは管孔系のBoletaceaeに近い糖の構成を示す。Using gas chromatographic technique, the compositions of carbohydrates from six Basidiomyceteses and one Ascomycetes were investigated by examination of acid hydrolysate of these fruit bodies. Four 2-amino-2-deoxy-D-hexoses (hexosamines) were converted to trimethylsilyl derivatives after treatment with formaline, and the peaks of these TMS-hexosamines were well separated from each other. The hydrolysates of some fruit bodies were analysed for 2-amino-2-deoxy-D-hexose (hexosamine) by the gas chromatography, and it was shown that all contained the 2-amino-2-deoxy-D-glucose. The carbohydrate composition of Phylloporus rhodoxanthus was similar to that of Boletaceae and not to that of Paxillus. This fact may support the theory that Phylloporus rhodoxanthus belongs to Boletaceae

電気的形質転換法を用いた cDNA ライブラリーの作製(農芸化学部門)

電気的形質転換法を用いプラスミドDNAを導入することにより大腸菌を形質転換した。我々は高効率を得る工夫をし, この方法を用いることでコンピテントセルを用いる形質転換法(Hanahan法)では出せない高効率を得ることが可能になった。ここではこの方法で登熟期イネ胚乳及びホウレンソウ芽生えよりcDNAライブラリーの作製に成功した。To transform Escherichia coli a plasmid DNA was introduced by electroporation. We improved transformation efficiency adding several chemicals, biological materials and/or preheating of the buffer solution which was added just affer electrodischarge. The improved method gave higher transformation efficiency comparing with that of Hanahan\u27s. cDNA libraries for mRNAs appearing in the developing rice seeds and spinach seedlings were constructed using this method

PCR (Polymerase Chain Reaction) を用いたイネ種子一粒の組織からの cDNA library 構築(農芸化学部門)

通常,植物のcDNAライブラリー構築には数十∿数百グラムの材料を必要とし,器官レベルまでの構築が限界であった。本研究では,PCR法を用いイネ種子一粒を出発材料にして組織,細胞レベルのcDNAライブラリー構築を目指した。その結果,登熟イネ種子の三分の一粒相当から得たアリューロン層,デンプン性胚乳に対応するcDNAライブラリーを構築することが出来た。胚乳ライブラリーからは1.3kbpのグルテリンcDNAクローン,0.6kbpの全長プロラミンcDNAクローンの存在を確認した。同様に,アリューロン層cDNAライブラリーからは数種のアリューロン層特異的クローンを得ることができた。これらのことより,この方法を用い組織,細胞レベルでの遺伝子発現機構が厳密に調査可能であることが判った。We constructed a cDNA library from a single developing rice grain. RNA was obtained from a sheet of manually peeled aleurone layer from one third of a single rice grain. Single stranded cNDAs were amplified using the PCR technique after oligo (dG) tails were introduced on the 3\u27-ends of the single stranded cDNAs obtained directly from the mRNAs. The resulting cDNAs were ligated into Bluescript SK+to obtain a cDNA library consisting of about 10^6 individual clones

葉および種子の脂質 IV : 植物リパーゼの活性と脂質(農芸化学部門)

植物リパーゼが有機溶媒による脱脂によって活性低下を起こしやすい現象について, ヒマシリパーゼを試料として検討を行なった。ヒマ種子を直接有機溶媒で処理して脱脂したものでは通常リパーゼは完全に失活する。しかし緩衝液を用いて抽出した粗酵素液から, 注意して冷エーテルまたは非イオン界面活性剤で結合脂質を除去してゆくと, 酵素中の脂質含量の減少とともにリパーゼ活性は低下するが, なお活性は残存し, これに抽出した脂質を添加すると活性はかなり回復する。このリパーゼ活性発現に必須の脂質はアセトン可溶性の中性脂質部にあり, 特にリシノール酸を含むトリグリセリドに顕著な効果が認められた。したがってヒマシリパーゼは脂質-タンパク質複合体として酵素作用を発揮するものと考えられる。Lipase activity of castor bean was lost by direct treatment of castor bean meal with most organic solvents, but it remained when the bound lipids of lipase were removed from the crude lipase solution by careful extraction with cold diethyl ether or a nonionic surfactant. The activity was reduced with decreasing the lipid content in a lipase preparation, and it was restored when the lipid extracts, especially acetone-soluble "neutral lipids", were added back to the delipidized lipase preparation with reduced activity. Obvious restoration of the lipase activity was observed on addition of ricinoleo-triglycerides which might serve as a lipid cofactor in castor bean lipase

電気的ブロッティング法を用いる cDNA クローンの抗体スクリーニング(農芸化学部門)

大腸菌発現ベクターpUC 9を用いて作製したcDNAライブラリーから電気的ブロッティング法を用いる抗体スクリーニングを行った。ここに示す電気的ブロッティング法を使用すると, 従来の抗体スクリーニング法で障害となる非特異的吸着によるバックグラウンドをほとんど除去出来た。ここでは, 登熟期イネ種子について作製したcDNAライブラリーより, プロラミン抗体を用いてプロラミンcDNAの一つをスクリーニングする過程を例として示し, この方法の特徴を解説する。A cDNA library constructed using plasmid expression vector, pUC 9,was screened immunologically after the products of the transformed cells were electrically transfered to nitrocellulose filter. Electroblotting technic mentioned here reduced remarkably the background which interfered strongly the identification of the target clones. In this paper, an example is shown in which a clone carring rice prolamin cDNA sequence was screened from a cDNA library for developing rice seed using the electroblotting technic

菌類の構成糖に関する生化学的研究 IV : Russula Pseudodelica の子実体 glycoprotein について(農芸化学部門)

Russula pseudodelicaの子実体から10%水酸化カリウム水溶液で抽出され, 酢酸で中和することにより沈殿してくるglycoproteinは, その構成アミノ糖として2-amino-2-deoxy-glucose以外に2-amino-2-deoxy-mannoseを含有する。アミノ糖はそのglycoproteinを加水分解後, アミノ酸分析機により, 又アミノ糖をホルマリン処理後TMS化し, ガスクロマトグラフィーで確認した。マススペクトルの結果から, アミノ糖のアミノ基はホルマリンとの処理によりメチレンイミノ基にblockされている事が明になった。2-Amino-2-deoxy-mannose and 2-amino-2-deoxy-glucose have been identified as a component of the wall glycoprotein of fruitbody of Russula pseudodelica