Lagere organismen als alternatief voor toxiciteitsonderzoek in knaagdieren. Met speciale aandacht voor Caenorhabditis elegans en de zebravis (Danio rerio)

De rondworm C. elegans en het embryo van de zebravis zijn veelbelovende alternatieve testmodellen voor onderzoek naar schadelijke effecten van chemische stoffen in knaagdieren. Proeven met deze lagere organismen hebben naar verwachting een goede voorspellende waarde voor effecten in de mens en zijn daarmee een zinvolle aanvulling op testen met in-vitromodellen (celcultures). Dit blijkt uit een inventariserend literatuuronderzoek, uitgevoerd in opdracht van het ministerie van VWS. Het onderzoek is onderdeel van het beleid om dierproeven te verminderen, te vervangen of te verfijnen (het zogeheten 3V-beleid). Nader onderzoek naar de validatie van de testen moet nog plaatsvinden. In-vitromodellen gelden als een belangrijk alternatief voor dierproeven maar missen de complexiteit van het menselijk organisme. Hierdoor kunnen in-vitromodellen bepaalde effecten niet signaleren, zoals indirecte schadelijke effecten van stoffen of effecten ervan nadat ze in het organisme zijn omgezet en daardoor een andere structuur hebben gekregen. De lagere organismen C. elegans en het zebravisembryo kunnen deze tekortkomingen overbruggen. Bovendien ervaren ze geen ongerief, zoals pijn, vanwege de lage graad waarin hun zenuwstelsel is ontwikkeld. Testen met C. elegans en het zebravisembryo kunnen voor veel soorten toxicologisch onderzoek worden gebruikt. Voorbeelden zijn de vorming van tumoren en schadelijke effecten van stoffen op de voortplanting, het hormoonstelsel, het hart en het zenuwstelsel. Bovendien zijn experimenten gaande waarbij deze organismen worden gebruikt in het veiligheidsonderzoek van nieuwe geneesmiddelen.The nematode C. elegans and the zebrafish embryo are promising alternative test models for assessment of toxic effects in rodents. Tests with these lower organisms may have a good predictive power for effects in humans and are thus complementary to tests with in vitro models (cell cultures). However, all described tests need further validation. This is the outcome of a literature survey, commissioned by the ministry of Health, Welfare and Sport of the Netherlands. The survey is part of the policy to reduce, refine and replace animal testing (3R policy). In vitro models are considered as important alternatives for animal testing but lack the complexicity of the human organism. Therefore, certain effects cannot be detected in in vitro models, such as indirect toxic effects or effects of compounds after chemical conversion to an active form in the whole organism. C. elegans and the zebrafish embryo can complement these shortcomings. These lower organisms can be considered as alternative test models because they do not experience inconvenience (such as pain) in the tests due to the low developmental state of their nervous system. Tests with C. elegans and the zebrafish embryo are available for many types of toxicological research. Examples are the formation of tumours and toxic effects on reproduction, on the endocrine system, the heart, and the nervous system. A specific application of these organisms is in the safety assessment of new pharmaceutical products.VW

Bijdrage aan risico op chronische ziekten door epigenetische programmering

Dit is de openbare versie van het rapport. Er is ook een vertrouwelijke versie met rapportnummer 340013002; deze bevat als extra appendix 2 en 3Epigenetische programmering is een fysiek mechanisme dat ervoor zorgt dat lichaamsfuncties goed zijn aangepast aan invloeden uit de omgeving. Het kan worden voorgesteld als schakelaars die de activiteit van celfuncties bepalen. Als het schakelbord van de cel van een kind tijdens de zwangerschap niet goed wordt ingesteld, kan dit later in het leven negatieve gevolgen hebben. De cel functioneert dan niet goed, oftewel gaat minder adequaat op de omgeving reageren. Zulke celverstoringen kunnen op verschillende manieren ontstaan, bijvoorbeeld door ongebalanceerde voeding, chemische verontreinigingen in voedsel, en tabaksrook. Epigenetische programmering kan zo het risico vergroten dat iemand een chronische ziekte ontwikkelt, zoals overgewicht, diabetes, hart- en vaatziekten, sommige allergieën en kanker. Uit literatuuronderzoek van het RIVM blijkt dat de verstoring van de epigenetische programmering een reëel fenomeen is. Hoe groot de bijdrage uit de omgeving op verstoringen is, is nog niet duidelijk. Wel kan dit gegeven de toename van de genoemde aandoeningen in de laatste jaren helpen verklaren. Er zijn technieken beschikbaar die gebruikt kunnen worden om de bijdrage van omgevingsfactoren aan verstoring van het epigenetisch programma te meten en in de literatuur worden hiervoor meerdere testmethoden beschreven. Het RIVM stelt voor om deze testmethoden nader uit te werken. Met goede testmethoden kunnen in de toekomst risico's van blootstellingen tijdens zwangerschappen beter worden ingeschat en gerichte beleidsadviezen worden opgesteld. Het belang van epigenetische programmering bleek voor het eerst bij kinderen van zwangere vrouwen die in de hongerwinter van de Tweede Wereldoorlog ondervoed waren. Deze kinderen bleken later in hun leven vaker te lijden aan chronische ziekten als diabetes dan leeftijdsgenoten die de ondervoeding niet hoefden te doorstaan. Een ander voorbeeld is een tijdens de zwangerschap doorgemaakte blootstelling aan een vocht- en vuilafstotend middel, waarna vaccinaties minder effectief bleken te zijn op het moment dat de kinderen de schoolleeftijd hebben bereikt.Epigenetic programming is a physical mechanism that enables adaptation of body functions to environmental conditions. It can be considered as switches that determine the activity of cell functions. Inproper adjustment of the cellular switch board early in life can have negative consequences later in life. The cell will not function properly, it will not respond adequately on external stimuli. There are various ways that can lead to such disruption of cell functions, including imbalanced diet, chemical contaminants in food, and tobacco smoke. Through this mechanism, epigenetic programming can contribute to the risk of chronic disease, such as overweight, diabetes, heart failure, some allergies, and cancer. A literature review by RIVM shows that disruption of epigenetic programming is undisputed. However, it is not yet possible to estimate the actual contribution of environmental conditions on such disruption. On the other hand, this paradigm could contribute to the explanation of rising trends of chronic disease in recent years. Techniques are available to measure the contribution of environmental factors to disruption of epigenetic programming, and in literature, several methods have been proposed to fill that gap. RIVM proposes further development of such methods. Validated test methods could be used to improve estimation of the risk of environmental exposures during pregnancy, and thus contribute to regulatory advice. The importance of epigenetic programming was first suggested in children of mothers who experienced undernutrition during pregnancy at the time of the Dutch Hunger Winter. As middle aged adults, these children had higher rates of chronic diseases such as diabetes as compared to people of the same age who did not suffer the undernutrition. Another example is prenatal exposure to a repellent, which is associated with reduced vaccination efficiency at school age.NVW

Identificatie van effecten door hormoonverstoring in het aquatische milieu: een partial life cycle studie met zebravissen.

In this project, an assay was developed and applied to identify hormone active substances in the aquatic environment. Laboratory fish were exposed during the reproductive and development phase to a range of established endocrine active compounds; these were estrogen (17 beta-estradiol), anti-estrogen (tamoxifen), androgen (methyldihydrotestosterone), anti-androgen (flutamide), and an antithyroid compound (propylthiouracil); also a field sample from a national field study (LOES) was tested. Parameters were fecundity, fertility, development, plasma vitellogenin, and histopathology with emphasis on gonads; for vitellogenin, (immuno)histochemistry detection methods were developed, as an alternative for the common ELISA methods. This approach enables the identification of a variety of endocrine effects within a relatively short period (9wk); histopathology is the most specific and sensitive parameter for the reference compounds used. Changes in sex ratio of offspring appears the most sensitive endpoint with relevance for reproduction fitness. The educational histopathology database from this project is available on the Internet (http://www.rivm.nl/fishtoxpat/).In dit project is een testmodel ontworpen en toegepast voor de identificatie van hormoonactieve stoffen in het aquatisch milieu. In het laboratorium zijn zebravissen gedurende de reproductie en ontwikkelingsfase blootgesteld aan een reeks bekende hormoonactieve stoffen, te weten een oestrogeen (17 beta-oestradiol) , een anti-oestrogen (tamoxifen), androgeen (methyldihydro-testosteron), anti-androgeen (flutamide), een schildklierremmer (propylthiouracil); tenslotte is een veldmonster getest in het kader van het landelijk onderzoek oestrogene stoffen (LOES). Onderzocht zijn parameters voor eiproductie, vruchtbaarheid en ontwikkeling van het eieren en nageslacht. Daarnaast is het plasmaeiwit vitellogenine bepaald, dat een maat is oestrogene activiteit. Hiervoor zijn (immuno)histochemische bepalingsmethoden ontwikkeld als alternatief voor de klassieke ELISA. Voorts zijn dieren histopathologisch onderzocht op afwijkingen in (ontwikkeling van) geslachtsorganen en endocriene organen. Uit de resultaten blijkt dat met het testsysteem binnen een betrekkelijk korte blootstellingsperiode (9 weken) inzicht verkregen kan worden in effecten van hormoonverstoring op het niveau van reproductie en ontwikkeling, waarbij met name het histopathologisch onderzoek een cruciale rol speelt, zowel betreffende gevoeligheid als specificiteit voor alle geteste referentiestoffen. Verstoring in de geslachtsverhouding blijkt het meest gevoelige voor de voortplanting relevante effect te zijn. De histopathologische bevindingen staan in de vorm van een educatieve atlas op Internet (http://www.rivm.nl/fishtoxpat/)

Identificatie van effecten door hormoonverstoring in het aquatische milieu: een partial life cycle studie met zebravissen.

In dit project is een testmodel ontworpen en toegepast voor de identificatie van hormoonactieve stoffen in het aquatisch milieu. In het laboratorium zijn zebravissen gedurende de reproductie en ontwikkelingsfase blootgesteld aan een reeks bekende hormoonactieve stoffen, te weten een oestrogeen (17 beta-oestradiol) , een anti-oestrogen (tamoxifen), androgeen (methyldihydro-testosteron), anti-androgeen (flutamide), een schildklierremmer (propylthiouracil); tenslotte is een veldmonster getest in het kader van het landelijk onderzoek oestrogene stoffen (LOES). Onderzocht zijn parameters voor eiproductie, vruchtbaarheid en ontwikkeling van het eieren en nageslacht. Daarnaast is het plasmaeiwit vitellogenine bepaald, dat een maat is oestrogene activiteit. Hiervoor zijn (immuno)histochemische bepalingsmethoden ontwikkeld als alternatief voor de klassieke ELISA. Voorts zijn dieren histopathologisch onderzocht op afwijkingen in (ontwikkeling van) geslachtsorganen en endocriene organen. Uit de resultaten blijkt dat met het testsysteem binnen een betrekkelijk korte blootstellingsperiode (9 weken) inzicht verkregen kan worden in effecten van hormoonverstoring op het niveau van reproductie en ontwikkeling, waarbij met name het histopathologisch onderzoek een cruciale rol speelt, zowel betreffende gevoeligheid als specificiteit voor alle geteste referentiestoffen. Verstoring in de geslachtsverhouding blijkt het meest gevoelige voor de voortplanting relevante effect te zijn. De histopathologische bevindingen staan in de vorm van een educatieve atlas op Internet (http://www.rivm.nl/fishtoxpat/).In this project, an assay was developed and applied to identify hormone active substances in the aquatic environment. Laboratory fish were exposed during the reproductive and development phase to a range of established endocrine active compounds; these were estrogen (17 beta-estradiol), anti-estrogen (tamoxifen), androgen (methyldihydrotestosterone), anti-androgen (flutamide), and an antithyroid compound (propylthiouracil); also a field sample from a national field study (LOES) was tested. Parameters were fecundity, fertility, development, plasma vitellogenin, and histopathology with emphasis on gonads; for vitellogenin, (immuno)histochemistry detection methods were developed, as an alternative for the common ELISA methods. This approach enables the identification of a variety of endocrine effects within a relatively short period (9wk); histopathology is the most specific and sensitive parameter for the reference compounds used. Changes in sex ratio of offspring appears the most sensitive endpoint with relevance for reproduction fitness. The educational histopathology database from this project is available on the Internet (http://www.rivm.nl/fishtoxpat/).EU-DG SANCOVROM-DGM-SA

Voorspelling van carcinogeniteit van chemische stoffen door gebruik van gegevens uit kortdurende toxiciteitstudies

Voordat een chemische stof op de markt kan worden gebracht, is de producent verplicht om aan te tonen dat de stof geen verhoogd risico geeft op kanker. De klassieke test hiervoor is een tweejarige proefdiertest, die een zeer groot aantal proefdieren vereist en bovendien relatief veel vals positieve resultaten geeft. In bepaalde gevallen is een kortdurende toxiciteitstudie, die negentig dagen duurt, een mogelijk alternatief. Hierdoor zouden aanzienlijk minder proefdierstudies nodig zijn, zonder de volksgezondheid in gevaar te brengen. Dit blijkt uit een literatuurstudie van het RIVM. In de literatuurstudie van het RIVM is onderzocht of resultaten uit kortdurende toxiciteitsstudies kunnen voorspellen of een stof kankerverwekkend is. Als je in een kortdurende test toxische effecten vindt, bijvoorbeeld een toename in de celdeling of sterk vergrootte cellen, dan zegt dit nog steeds weinig of de stof wel of niet kankerverwekkend is. Toxische effecten bleken namelijk met wisselend succes te voorspellen of een stof kankerverwekkend is. Bij dergelijke resultaten is dan toch de langdurige dierstudie nodig om hierover duidelijkheid te krijgen. Daar staat tegenover dat als je geen effect vindt de stof ook hoogstwaarschijnlijk geen kanker veroorzaakt. In dit geval is een tweejarige test niet nodig. Deze studie laat zien dat de huidige criteria om tot een tweejarige dierproefstudie over te gaan, kunnen worden verfijnd.Industry is required to test substances for their carcinogenic potential before they can be marketed. The conventional test for carcinogenicity is the long-term rodent carcinogenicity bioassay. However, this assay has several drawbacks. An alternative approach to determine the carcinogenic features of substances would be to use data from sub-chronic repeated dose toxicity studies. This approach could lead to a substantial reduction in the number of carcinogenicity studies performed without compromising human safety. This is concluded from a literature review carried out by the National Institute for Public Health and the Environment (RIVM). The evaluation of relevant studies reported in the literature shows that the performance of histopathological lesions in sub-chronic toxicity studies as early indicators for the identification of carcinogenic substances varies highly. In contrast, the absence of evidence of histopathological lesions, hormonal perturbation and genotoxicity can be very accurate in predicting the lack of carcinogenic potential. Data derived from the literature support the refinement of current regulatory safety criteria for conducting two-year rat studies.VW

Prediction of carcinogenic potential of substances using repeated dose toxicity data

Voordat een chemische stof op de markt kan worden gebracht, is de producent verplicht om aan te tonen dat de stof geen verhoogd risico geeft op kanker. De klassieke test hiervoor is een tweejarige proefdiertest, die een zeer groot aantal proefdieren vereist en bovendien relatief veel vals positieve resultaten geeft. In bepaalde gevallen is een kortdurende toxiciteitstudie, die negentig dagen duurt, een mogelijk alternatief. Hierdoor zouden aanzienlijk minder proefdierstudies nodig zijn, zonder de volksgezondheid in gevaar te brengen. Dit blijkt uit een literatuurstudie van het RIVM. In de literatuurstudie van het RIVM is onderzocht of resultaten uit kortdurende toxiciteitsstudies kunnen voorspellen of een stof kankerverwekkend is. Als je in een kortdurende test toxische effecten vindt, bijvoorbeeld een toename in de celdeling of sterk vergrootte cellen, dan zegt dit nog steeds weinig of de stof wel of niet kankerverwekkend is. Toxische effecten bleken namelijk met wisselend succes te voorspellen of een stof kankerverwekkend is. Bij dergelijke resultaten is dan toch de langdurige dierstudie nodig om hierover duidelijkheid te krijgen. Daar staat tegenover dat als je geen effect vindt de stof ook hoogstwaarschijnlijk geen kanker veroorzaakt. In dit geval is een tweejarige test niet nodig. Deze studie laat zien dat de huidige criteria om tot een tweejarige dierproefstudie over te gaan, kunnen worden verfijnd

Systems biology ter verbreding van de toepasbaarheid van in vitro testen in de toxicologie

VW