Vitrification et maturation in vitro de l'ovocyte humain

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Valeur prédictive du MSOME sur le développement embryonnaire et sur l'issue de l'ICSI

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Autoconservation ovarienne (pratiques de l'autoconservation ovarienne au sein du département de Médecine de la Reproduction : études expérimentales de folliculogénèse in vitro chez l'ovin)

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La congélation de tissu ovarien (analyse rétrospective des autoconservations ovariennes au CHU de Lyon, influence d'une chimiothérapie avant le prélèvement ; comparaison de deux protocoles de conservation de tissu ovarien humain, la congélation lente et la vitrification)

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Facteurs toxiques et fertilité (cas particulier du cannabis)

Environ 15% des couples consultent pour difficulté à concevoir au moins une fois dans leur vie, soit d'après l'Agence de la Biomédecine, 60 000 couples chaque année en France. La médecine de la reproduction présente un intérêt grandissant pour l'environnement en raison de l'altération régulière des paramètres spermatiques des donneurs fertiles dans les pays industrialisés, ainsi que de l'incidence croissante de l'infertilité conjugale. Il s'agit d'une étude prospective observationnelle mono centrique menée entre le 1er septembre 2013 et le 30 octobre 2013 dans le service de médecine de la reproduction de l'hôpital femme mère enfant de Lyon. Un questionnaire nominatif avait été établit après revue de la littérature recensant les principaux facteurs toxiques et environnementaux pouvant être impliqués dans une baisse de la fertilité spontanée et en AMP. Il est à souligner le fort taux de participation à notre étude qui est de 79.9% (191 couples). En ce qui concerne le tabagisme actif, il existe une augmentation significative du taux d'oligospermie (48.4% sans tabac versus 69.7% en cas de consommation p 0.002), d'asthénospermie (21% sans tabac versus 26,1%) et une diminution du nombre de grossesses évolutives (10.6% versus 17.7% dans le groupe exposé) . Il n'est pas noté d'impact de la consommation d'alcool sur les paramètres spermatiques ni en terme de grossesse évolutive mais il est remarquable qu'en cas de consommation d'alcool quotidienne aucune grossesse n'est obtenue. En cas de consommation de cannabis, il est constaté une majoration significative du taux d'oligospermie (p 0.05) ainsi que du taux d'asthénospermie (42.9% versus 35% non significatif), nous observons une diminution de plus de 50% du taux de grossesse avec un taux de 10% en cas d'exposition versus 22.4% en l'absence d'exposition (p 0.92). Il a été mis en évidence une vraie incidence de la consommation de facteurs toxiques et d'une exposition aux facteurs médicamenteux et environnementaux dans notre population d' AMP. Par ailleurs, il existe une réelle influence de ces facteurs tant en terme de fertilité spontanée (notamment en terme de paramètres spermatiques) qu' en terme d'aide médicale à la procréation. Il y a donc un intérêt à développer dans nos services d'AMP une politique d'information sur les méfaits de ces facteurs et éventuellement un encouragement au sevrage des facteurs addictifs et une promotion de l'activité sportiveLYON1-BU Santé (693882101) / SudocSudocFranceF

An Update on In Vitro Folliculogenesis: A New Technique for Post-Cancer Fertility

Introduction: Obtaining in vitro mature oocytes from ovarian tissue to preserve women’s fertility is still a challenge. At present, there is a therapeutic deadlock for girls and women who need emergency fertility preservation in case of a high risk of ovary invasion by malignant cells. In such a case, ovarian tissue cannot be engrafted; an alternative could be in vitro folliculogenesis. Methods: This review focuses on the progress of in vitro folliculogenesis in humans. PubMed and Embase databases were used to search for original English-language articles. Results: The first phase of in vitro folliculogenesis is carried out in the original ovarian tissue. The addition of one (or more) initiation activator(s) is not essential but allows better yields and the use of a 3D culture system at this stage provides no added value. The second stage requires a mechanical and/or enzymatic isolation of the secondary follicles. The use of an activator and/or a 3D culture system is then necessary. Conclusion: The current results are promising but there is still a long way to go. Obtaining live births in large animals is an essential step in validating this in vitro folliculogenesis technique

Cryoconservation ovarienne (étude de la folliculogenèse in vitro chez l ovin et chez l humain)

Culture of ovarian cortex can be an alternative to autograft after ovarian cryopreservation. To improve follicular survival after freezing we evaluated the influence of the sheep cortex width; 0.5 vs 1mm, of the culture support and the cryoprotector DMSO 2M vs PROH 1.5M + sucrose 0.3M. The 1mm tissue width on millicell filter with the 2DMSO 2M freezing protocol displayed better results with 39% follicular survival on the 4th day of culture. On fresh human and sheep tissue, we explored a potential expression deficit in culture of Gdf9, Bmp15 and their receptors; this would explain the blocking of follicular growth in vitro. In both cases the level of ARNm and proteins Gdf9 and Bmp15 is maintained and so is the protein formula of their BmprIA, BmprIB, BmprII receptors. This study shows how survival in culture after cryopreservation can be optimised; the reason of the growth blocking remains to be determinedLa culture de cortex ovarien se pose comme une alternative à l autogreffe après autoconservation ovarienne. Pour améliorer la survie folliculaire après congélation, nous avons évalué chez la brebis l influence de l épaisseur de cortex ; 0,5 vs 1mm, du support de culture et du cryoprotecteur DMSO 2M vs PROH 1,5M+sucrose 0,3M. L épaisseur de tissu de 1mm sur filtre millicell avec le protocole de congélation DMSO 2M a montré les meilleurs résultats avec 39% de survie folliculaire au 4e jour de culture. Sur tissu frais de brebis et humain, nous avons exploré un éventuel déficit d expression en culture de Gdf9, de Bmp15 et de leurs récepteurs qui expliquerait le blocage de croissance folliculaire in vitro. Dans les deux modèles la présence des ARNm et des protéines de Gdf9 et Bmp15 est maintenue et l expression protéique de leurs récepteurs BmprIA, BmprIB, BmprII est conservée. Ce travail montre que la survie en culture après cryoconservation peut être optimisée, la cause du blocage de croissance reste à définirLYON1-BU.Sciences (692662101) / SudocSudocFranceF

Cryoconservation ovarienne et transplantation ovarienne chez la brebis (mise au point d un protocole de vitrification d ovaire entier avec son pédicule vasculaire)

Introduction: La cryoconservation ovarienne est une stratégie pour préserver la fertilité avant un traitement anticancéreux. Objectif: Etude d une technique de vitrification d ovaire entier avec son pédicule vasculaire chez la brebis. Matériels et méthodes: (1) Etude de la cytotoxicité des solutions cryoprotectrices VS1 et VS4. (2) Etude calorimétrique des propriétés thermiques nécessaires à la vitrification avec du VS4 ; étude des conditions de réchauffement. (3) Développement d une technique de transplantation ovarienne. Résultats: (1) VS4 était moins cytotoxique que VS1. (2) L étude du cortex ovarien imprégné par du VS4 a révélé la présence de cristaux de glace. Un réchauffement en deux temps a évité les fractures survenant avec un réchauffement rapide. (3) La transplantation ovarienne a montré sa faisabilité avec une reprise de la fonction ovarienne. Conclusion : Notre travail ouvre une voie de recherche passionnante sur le thème de la vitrification d un organe comme l ovaireIntroduction: Ovarian cryopreservation is a research way for fertility preservation before anticancerous treatment. Objective: To evaluate a cryopreservation technique by vitrification of whole ovaries with their vascular pedicle in sheep. Materials and methods: (1) Study the cytotoxicity of two cryoprotectant solutions VS1 and VS4. (2) Thermal properties necessary for vitrification with VS4 were measured by differential scanning calorimetry. Study of two rewarming s procedures. (3) Evaluation of an ovarian transplantation s technique. Results: (1) VS4 was less cytotoxic than VS1. (2) The study of ovarian cortex impregnated by VS4 revealed the presence of ice crystals. A two-step rewarming has avoided fractures occurring with a rapid rewarming. (3) Ovarian transplantation was technically feasible with a recovery of endocrine ovarian function. Conclusion: Our work opens an exciting line of research on the subject of vitrification of an organ as the ovaryLYON1-BU.Sciences (692662101) / SudocSudocFranceF

Safeguarding Fertility With Whole Ovary Cryopreservation and Microvascular Transplantation

International audienceBACKGROUND:In young women, ovarian cortex cryopreservation before gonadotoxic chemotherapy and its avascular grafting after cancer healing permitted fertility restoration. However, ischemia reduced the grafts' lifespan. Microvascular transplantation of cryopreserved whole ovary may allow immediate revascularization, ensuring better fertility preservation, but the best cryopreservation method is unknown. We aimed to compare slow freezing and vitrification of whole ovary for fertility preservation purposes, in an ewe model.METHODS:Twelve ewes were allocated at random to slow freezing (n = 6) or vitrification group (n = 6). Ewes' left ovary was removed and cryopreserved. Dimethyl sulfoxide 2 M was used as cryoprotector for slow freezing. Vitrification was obtained using increasing concentrations of a vitrification solution of the latest generation (VM3) and gradual temperature lowering to minimize toxicity. After a month, the right ovary was removed, the left ovary was thawed/warmed, and its vessels were anastomosed to the right pedicle. Fertility and ovarian function were assessed for 3 years. Ovarian follicles in native and transplanted ovaries were counted and compared at study completion.RESULTS:Hormonal secretion resumed in all ewes of both groups. One ewe of the slow-freezing group delivered healthy twins 1 year 9 months and 12 days after transplantation. Estimated whole follicle survival was very low in both groups but significantly higher after vitrification than after slow freezing (0.3% ± 0.5% vs 0.017% ± 0.019%, respectively; p < 0.05).CONCLUSIONS:Further progress is needed before whole-ovary cryopreservation can be considered an option for safeguarding fertility. Whole ovary vitrification provides better follicular survival compared to slow freezing and may be a valuable cryopreservation option

Examination of viability and quality of ovarian tissue after cryopreservation using simple laboratory methods in ewe.

Presented at meeting ESHRE. Lyon 2007International audienceBACKGROUND: The objective of the present study is to assess viability tests and to evaluate follicle ovarian tissue quality after freezing-thawing procedures. METHODS: Ewe's ovaries were harvested at the slaughterhouse, after dissection each ovarian specimen was divided into two groups: fresh tissue (control group) and frozen tissue.In the first part of the study, the follicles viability was assessed by trypan blue staining, calcein AM/ethidium homodimer-1 staining (LIVE/DEAD viability/cytotoxicity kit, Molecular Probes) and morphology in the two groups. In the second part of the study the quality of the whole ovarian tissue was evaluated by the quantification of the release of lactate dehydrogenase measurement (Cytotoxicity Detection kit ROCHE), DNA fragmentation by terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labelling (TUNEL) in primordial and primary follicles (ApopDETEK Kit system Enzo) and morphology in the two groups. 100 Follicles (primordial and primary) were counted on both fresh and frozen hemiovary to assess this various tests. RESULTS: Ovarian follicle viability assessment was similar using trypan blue or calcein/ethidium staining. Follicles showed a decreased viability after freezing-thawing.After cryopreservation, a significant correlation between the percentage of normal follicles and viability rate was found using trypan blue (r=0.82, p<0.05) or calcein AM/ethidium homodimer-1 staining (r=0.76, p<0.05). Increased cytotoxicity showed by enhancement of LDH release was found after cryopreservation (21.60+/-1.1% vs 52.2+/-7.7%). A significant negative correlation between the percentage of morphologically normal follicles and cytotoxicity was observed. No significant difference in DNA fragmentation rate between frozen and control groups was found (26±8.2% vs 38±4.5%). CONCLUSION: We suggest the use of trypan blue staining for the histological assessment of viability, the use of LDH assay for the cytotoxicity assessement and finally the use of DNA fragmentation assessment to valid different freezing-thawing protocols