Application of flow cytometry to wine microorganisms

International audienceFlow cytometry (FCM) is a powerful technique allowing detection and enumeration of microbial populations in food and during food process. Thanks to the fluorescent dyes used and specific probes, FCM provides information about cell physiological state and allows enumeration of a microorganism in a mixed culture. Thus, this technique is increasingly used to quantify pathogen, spoilage microorganisms and microorganisms of interest. Since one decade, FCM applications to the wine field increase greatly to determine population and physiological state of microorganisms performing alcoholic and malolactic fermentations. Wine spoilage microorganisms were also studied. In this review we briefly describe FCM principles. Next, a deep revision concerning enumeration of wine microorganisms by FCM is presented including the fluorescent dyes used and techniques allowing a yeast and bacteria species specific enumeration. Then, the last chapter is dedicated to fluorescent dyes which are used to date in fluorescent microscopy but applicable in FCM. This chapter also describes other interesting "future" techniques which could be applied to study the wine microorganisms. Thus, this review seeks to highlight the main advantages of the flow cytometry applied to wine microbiology

La cytométrie appliquée aux mircoorganismes du vin

International audienceFlow cytometry (FCM) is a powerful technique allowing detection and enumeration of microbial populations in food and during food process. Thanks to the fluorescent dyes used and specific probes, FCM provides information about cell physiological state and allows enumeration of a microorganism in a mixed culture. Thus, this technique is increasingly used to quantify pathogen, spoilage microorganisms and microorganisms of interest. Since one decade, FCM applications to the wine field increase greatly to determine population and physiological state of microorganisms performing alcoholic and malolactic fermentations. We will describe FCM principles and the available techniques allowing quantification of wine microorganisms by FCM using fluorescent dyes. Different examples of FCM analysis regarding monitoring of alcoholic fermentation, malolactic fermentation (total population, viable population, physiological state), specific detection and quantification of spoilage microorganisms like Brettanomyces will be presented

La cytométrie appliquée aux mircoorganismes du vin

Flow cytometry (FCM) is a powerful technique allowing detection and enumeration of microbial populations in food and during food process. Thanks to the fluorescent dyes used and specific probes, FCM provides information about cell physiological state and allows enumeration of a microorganism in a mixed culture. Thus, this technique is increasingly used to quantify pathogen, spoilage microorganisms and microorganisms of interest. Since one decade, FCM applications to the wine field increase greatly to determine population and physiological state of microorganisms performing alcoholic and malolactic fermentations. We will describe FCM principles and the available techniques allowing quantification of wine microorganisms by FCM using fluorescent dyes. Different examples of FCM analysis regarding monitoring of alcoholic fermentation, malolactic fermentation (total population, viable population, physiological state), specific detection and quantification of spoilage microorganisms like Brettanomyces will be presented

Efficiency of population-dependent sulfite against Brettanomyces bruxellensis in red wine

International audienceBrettanomyces bruxellensis is considered as a spoilage yeast encountered mainly in red wine. It is able to reduce vinylphenols from phenolic acids to ethylphenols. These volatiles are responsible for the phenolic "Brett character" described as animal, farm, horse sweat and animal leather odors. Other molecules are responsible for organoleptic deviations described as "mousiness taint". SO2 is the product most often used by winemakers to prevent B. bruxellensis growth. Usually, the recommended molecular dose of SO2 (active SO2, mSO(2)) is highly variable, from 03 to 0.8 mg/L. But these doses do not take into account differences of strain resistance to sulfites or population levels. Moreover, SO2 is known as a chemical stressor inducing a viable but nonculturable (VBNC) state of B. bruxellensis. These cells, which are non-detectable by plate counting, can lead to new contamination when the amount of sulfite decreases over time. Consequently, we first assessed the effect of SO2 levels in red wine on two strains with phenotypically different sulfite resistances. Then, we studied the relationship between amounts of SO2 (0, 0.5, 0.9 and 1.1 mg/L active SO2) and population levels (10(3), 10(4) and 10(5) cells/mL) in red wine. Yeasts were enumerated by both plate counting and flow cytometry over time using viability dye. Our results showed different SO2 resistances according to the strain used. A relationship between yeast population level and SO2 resistance was demonstrated: the higher the yeast concentration, the lower the efficiency of SO2. Under certain conditions, the VBNC state of B. bruxellensis was highlighted in red wine. Yeasts in this VBNC state did not produce 4-EP. Moreover, cells became culturable again over time. All these results provide new information enabling better management of sulfite addition during wine aging

L’efficacité du sulfite sur Brettanomyces bruxellensis dépend de la population présente

International audienceBrettanomyces bruxellensis est une levure d’altération du vin avec de faibles besoins nutritionnels, résistante à l’éthanol et aux faibles pH, lui permettant une implantation en vin durant ou après la fermentation alcoolique (Conterno et al., 2006). B. bruxellensis est capable de produire des phénols volatils (éthyl-4-phénol, éthyl-4-gaïacol et éthyl-4-catéchol) (Oelofse et al., 2008). Ces molécules volatiles odorantes amènent un caractère phénolé et animal au vin connu sous le nom de « caractère Brett ». D’autres molécules (2-acetyltetrahydropyridine and 2-ethyltetrahydropyridine) produites par B. bruxellensis sont également responsables d’une déviation organoleptique appelée communément « goût de souris ». C’est pourquoi, différents traitements sont disponibles pour prévenir les contaminations par B. bruxellensis. Le sulfite reste le principal adjuvant utilisé pour éviter le développement de B. bruxellensis. Cependant, l’évaluation de l’efficacité du sulfite est complexe car cette levure peut être plus ou moins tolérante à ce traitement et l’efficacité est connue pour être souche dépendante (Barata et al., 2008)

Research on autobiographical memory (AM) and the ability to retrieve specific autobiographical events in euthymic depressed patients yielded divergent results. The main goal of the present study was to further explore episodic specificity of AM among fully remitted depressed patients. Twenty euthymic depressed patients and 20 matched healthy controls were given a semi-structured interview, which assesses episodic specificity of positive and negative autobiographical memories regarding event and details' specificity, autonoetic consciousness (remember/know procedure) and visual perspective (field/observer procedure). Results showed an impairment of episodic specificity of AM in euthymic depressed patients. This impairment was explained by a field perspective deficit for positive memories only. These results suggest that euthymic patients continue to exhibit discrepancy between their current self and their self for positive past behaviors, which maintains an unfavorable view of their current self. Specific cognitive interventions may improve the self-relevance of their positive memories.

International audienc

Quantification des Brettanomyces par qPCR : Étude de la fiabilité, répétabilité et reproductibilité des kits

Article de revue professionnelleBrettanomyces bruxellensis est une levure d’altération du vin avec de faibles besoins nutritionnels, résistante à l’éthanol et aux faibles pH, lui permettant une implantation en vin durant ou après la fermentation alcoolique (Conterno et al., 2006). B. bruxellensis est capable de produire des phénols volatils (éthyl-4-phénol, éthyl-4-gaïacol et éthyl-4-catéchol) (Oelofse et al., 2008). Ces molécules volatiles odorantes amènent un caractère phénolé et animal au vin connu sous le nom de « caractère Brett ». D’autres molécules (2-acétyltétrahydropyridine et 2-éthyltétrahydropyridine) produites par B. bruxellensis sont également responsables d’une déviation organoleptique appelée communément « goût de souris ». La détection et la quantification de cette levure sont donc nécessaires afin d’éviter l’altération du vin. L’isolement de cette levure sur milieu gélosé est utilisé en routine par les laboratoires spécialisés en œnologie. Cette méthode nécessite un temps d’incubation très long (> 7 jours) mais ne permet pas la quantification des cellules viables non cultivables. Des cultures en milieu liquide contenant les précurseurs des phénols volatils sont parfois effectuées afin de déterminer si les vins testés contiennent ou non B. bruxellensis. L’apparition de l’odeur « Brett » plus ou moins rapide permet d’avoir une estimation sur la quantité de cellules présentes. La cytométrie en flux est également un outil utilisé par les laboratoires afin de quantifier de manière spécifique B. bruxellensis : sonde spécifique fluorescente (Serpaggi et al., 2010), anticorps. En France comme à l’étranger, la principale méthode moléculaire utilisée est la PCR quantitative (qPCR). De nombreuses études portant sur cette dernière ont permis le développement de kits commerciaux afin de dénombrer spécifiquement B. bruxellensis dans le vin. Cependant, aucune étude n’a été effectuée sur la fiabilité, la répétabilité et la reproductibilité de ces kits. C’est pourquoi, dans cette étude, nous avons comparé les résultats obtenus en utilisant trois kits qPCR commerciaux permettant d’extraire l’ADN des cellules et de quantifier B. bruxellensis en vin rouge. Les analyses ont été effectuées par trois laboratoires sélectionnés, spécialisés en analyses œnologiques et sur trois vins rouges élaborés dans 3 régions différentes

Quantification des Brettanomyces par qPCR

International audienceBrettanomyces bruxellensis est une levure d’altération du vin avec de faibles besoins nutritionnels, résistante à l’éthanol et aux faibles pH, lui permettant une implantation en vin durant ou après la fermentation alcoolique (Conterno et al., 2006). B. bruxellensis est capable de produire des phénols volatils (éthyl-4-phénol, éthyl-4-gaïacol et éthyl-4-catéchol) (Oelofse et al., 2008). Ces molécules volatiles odorantes amènent un caractère phénolé et animal au vin connu sous le nom de « caractère Brett ». D’autres molécules (2-acétyltétrahydropyridine et 2-éthyltétrahydropyridine) produites par B. bruxellensis sont également responsables d’une déviation organoleptique appelée communément « goût de souris ».La détection et la quantification de cette levure sont donc nécessaires afin d’éviter l’altération du vin. L’isolement de cette levure sur milieu gélosé est utilisé en routine par les laboratoires spécialisés en œnologie. Cette méthode nécessite un temps d’incubation très long (> 7 jours) mais ne permet pas la quantification des cellules viables non cultivables. Des cultures en milieu liquide contenant les précurseurs des phénols volatils sont parfois effectuées afin de déterminer si les vins testés contiennent ou non B. bruxellensis. L’apparition de l’odeur « Brett » plus ou moins rapide permet d’avoir une estimation sur la quantité de cellules présentes. La cytométrie en flux est également un outil utilisé par les laboratoires afin de quantifier de manière spécifique B. bruxellensis : sonde spécifique fluorescente (Serpaggi et al., 2010), anticorps. En France comme à l’étranger, la principale méthode moléculaire utilisée est la PCR quantitative (qPCR). De nombreuses études portant sur cette dernière ont permis le développement de kits commerciaux afin de dénombrer spécifiquement B. bruxellensis dans le vin. Cependant, aucune étude n’a été effectuée sur la fiabilité, la répétabilité et la reproductibilité de ces kits.C’est pourquoi, dans cette étude, nous avons comparé les résultats obtenus en utilisant trois kits qPCR commerciaux permettant d’extraire l’ADN des cellules et de quantifier B. bruxellensis en vin rouge. Les analyses ont été effectuées par trois laboratoires sélectionnés, spécialisés en analyses œnologiques et sur trois vins rouges élaborés dans 3 régions différentes

Diversité des Brettanomyces et de leur résistance au SO2. Les nouvelles avancées vers une meilleure gestion du SO2 en vinification.

Article de revue professionnelleDes recherches ont été menées par le Groupe National « Lutte contre Brettanomyces » et plus particulièrement sur la relation SO2 et Brettanomyces bruxellensis afin d’approfondir les connaissances sur le comportement de la levure et d’apporter des données essentielles à une bonne gestion du risque. Une grande diversité de la levure Brettanomyces a été mise en évidence (identification de différents groupes génétiques) ainsi que des comportements différents vis-à-vis du SO2 : sensibles, tolérants ou résistant. Grâce à la mise au point d’un outil prédictif (TYP \ Brett), les professionnels pourront connaître le groupe génétique pour mieux intervenir. Ces travaux ont également mis en évidence la nécessité d’adapter la dose de SO2 actif en fonction du niveau de population de B. bruxellensis, mais également l’importance d’avoir des méthodes de détection estimant les niveaux de contamination réels de population viable en s’affranchissant des faux positifs (levures mortes ou viables non-cultivables). Un outil d’aide à la décision, le modèle Brett permettra de prédire le risque de développement de B. bruxellensis et la production de phénols en fonction des paramètres œnologiques du vin notamment la dose de SO2 actif. Il sera d’une grande utilité aux vignerons dans la lutte du risque Brettanomyces

New molecular evidence of wine yeast-bacteria interaction unraveled by non-targeted exometabolomic profiling

International audienceIntroduction Bacterial malolactic fermentation (MLF) has a considerable impact on wine quality. The yeast strain used for primary fermentation can systematically stimulate (MLF+ phenotype) or inhibit (MLF-) bacteria and the MLF process as a function of numerous winemaking practices, but the underlying molecular evidence still remains a mystery.Objectives The goal of the study was to elucidate such evidence by the direct comparison of extracellular metabolic profiles of MLF? and MLF-phenotypes.Methods We have applied a non-targeted metabolomic approach combining ultrahigh-resolution FT-ICR-MS analysis, powerful statistical tools and a comprehensive wine metabolite database.Results We discovered around 2500 unknown masses and 800 putative biomarkers involved in phenotypic distinction. For the putative biomarkers, we also developed a biomarker identification workflow and elucidated the exact structure (by UPLC-Q-ToF-MS2) and/or exact physiological impact (by in vitro tests) of several novel biomarkers, such as D-gluconic acid, citric acid, trehalose and tripeptide Pro-Phe-Val. In addition to valid biomarkers, molecular evidence was reflected by unprecedented chemical diversity (around 3000 discriminant masses) that characterized both the yeast phenotypes. While distinct chemical families such as phenolic compounds, carbohydrates, amino acids and peptides characterize the extracellular metabolic profiles of the MLF? phenotype, the MLF-phenotype is associated with sulphur-containing peptides.Conclusion The non-targeted approach used in this study played an important role in finding new and unexpected molecular evidence