Structural and functional studies on the ribosomal proteins THX, S20 and L4 from the thermophilic organism Thermus thermophilus

In the present thesis, three ribosomal proteins of particular structural and functional importance, namely Thx, S20 and L4, from Thermus thermophilus were studied. The Thx protein, an extremely small and basic protein (26 amino acids, 1 acidic and 13 basic residues, pI=T2.1), was found only in the thermophilic eubacteria T. thermophilus, T. aquaticus and T. flavus showing no homology with other known prokaryotic ribosomal proteins. In this work, the gene of the Thx protein was identified based on its already published amino acid sequence. Moreover, an operon was characterized consisting of two genes coding for proteins S20 and Thx, which were separated by 9 nucleotides, a feature characteristic of the compact T. thermophilus genome. They shared common promoter sequence 29 nucleotides upstream of ORF1 and possessed their own Shine-Dalgamo (GGAG) sequences. It should be pointed out that the S20 gene is monocistronic in all other prokaryotes. The function of the promoter was tested by its ability to transcribe the gene of the acetylotransferase of chloramphenicol. In addition, the nucleotide sequence of a 1.4 kb DNA region from T. thermophilus harboring the sequence of the S20-Thx operon was also characterized. The gene arrangement of Thx with S20, the absence of Thx from other prokaryotic organisms, as well as the recently published data about the contribution of Thx to the integrity of the 30S ribosomal subunit, indicated that thermophilic bacteria need molecules with special characteristics in order to survive at high temperatures. In the large ribosomal subunit take place the peptide bond formation at the peptidyl transferase center and the exit of the nascent polypeptide chain through a tunnel that traverses the subunit. The tunnel walls are made of RNA but the narrowest part of it is formed mainly by ribosomal proteins L22 and L4. In the present thesis the possible role of a specific and highly conserved glutamic acid at position 56 of L4 from T. thermophilus in protein biosynthesis (peptide bond catalysis and protein exit through the tunnel) was investigated. The Glu-56 was mutated to Ala, Gin and Asp and the neighboring amino acid Gly-55 to Ala, Ser and Glu. In addition, a double mutation was done in which Gly-55 changed into Glu and Glu-56 into Gly. The wild-type L4 and the mutants were incorporated into E. coli ribosomes. The activity of the ribosomes to form the peptide bond was tested with puromycin reaction. The k'3 values obtained from the puromycin reaction showed no direct implication of γ-carboxyl residue of glutamic acid-56 in the peptide bond formation. The results could be explained by an indirect implication of this amino acid by causing a perturbation of the conformation of 23S rRNA resulting in a possible "removal" of Adenine A2451Ec (E. coli) from the peptidyl transferase center. Additionally, the number of methylene groups of the residue at position 56 and, therefore, its chain length seemed to be important for the catalytic activity of the peptidyl transferase. The implication of Gly-55 suggested to be indirect too. Moreover, it was showed that the existence of alanine residue at position 55 was essential for the high catalytic activity of E. coli cells. The role of L4 in biosynthesis of nascent peptides and their passage through the tunnel was investigated by coupled transcription/translation in cell-free E. coli extracts containing either the wild-type L4 or one of the mutants. The proteins that synthesized with the various cell-free extracts were IF-1, IF-2, EF-G, Co and 5&6 both with and without the addition of the antibiotic erythromycin. Erythromycin binds at the entrance of the polypeptide channel and therefore it was used to make stronger the effect of L4. The results suggested that the nascent peptides interacted as they were elongated with L4 because there was a different rate of biosynthesis and a different pattern of the accumulating nascent peptides with the various cell-free extracts (containing the mutants of L4).Στην παρούσα διατριβή μελετήθηκαν τρεις ριβοσωμικές πρωτεΐνες του Τ. thermophilus, η Thx, η S20 και η L4, με ιδιαίτερη σημασία για τη δομή και τη λειτουργία του ριβοσώματος. Το γεγονός ότι η Thx είναι μία πολύ μικρή (2G αμινοξέα) και πολύ βασική πρωτεΐνη (pI=12,1) η οποία βρίσκεται στους θερμόφιλους οργανισμούς Τ. thermophilus, Τ. aquaticus και Τ. flavus ενώ απουσιάζει από άλλα βακτήρια σε συνδυασμό με την εντόπισή της μετά από κρυσταλλογραφικές μελέτες στην κορυφή της κεφαλής της 30S υπομονάδας του οργανισμού Τ. thermophilus, σε μία κοιλότητα αποτελούμενη από rRNA, την καθιστά ιδιαιτέρως ενδιαφέρουσα. Στην συγκεκριμένη εργασία ταυτοποιήθηκε το γονίδιο της Thx ξεκινώντας από την ήδη γνωστή αμινοξική της ακολουθία. Χρησιμοποιήθηκαν οι τεχνικές της PCR, της αντίστροφης PCR και του υβριδισμού κατά Southern. Στην πορεία ανεύρεσης του γονιδίου της διαπιστώθηκε ότι 9 νουκλεοτίδια ανοδικά ως προς το Ν-τελικό άκρο της βρίσκεται το γονίδιο της S20 ριβοσωμικής πρωτεΐνης και ότι τα δύο αυτά γονίδια αποτελούν ένα οπερόνιο με κοινό προαγωγέα σε απόσταση 29 νουκλεοτιδίων ανοδικά ως προς το Ν- τελικό άκρο της S20. Πριν από κάθε γονίδιο ταυτοποιήθηκε η χαρακτηριστική Shine-Dalgarno περιοχή. Η λειτουργία του προαγωγέα πιστοποιήθηκε πειραματικά, ελέγχοντας την ικανότητά του να μεταγράφει το γονίδιο της ακετυλοτρανσφεράσης της χλωραμφαινικόλης. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι το γονίδιο της S20 είναι μονοκιστρονικό σε άλλα βακτήρια. Επιπρόσθετα έγινε ανάλυση της νουκλεοτιδικής ακολουθίας μιας περιοχής 1,4 kb από το γονιδίωμα του Τ. thermophilus η οποία περιλαμβάνει τα γονίδια των δύο πρωτεϊνών S20 και Thx. Η L4 είναι πρωτεΐνη της μεγάλης υπομονάδας του ριβοσώματος η οποία συμμετέχει στην διαμόρφωση του στενότερου τμήματος του καναλιού από το οποίο διέρχονται οι νεοσυντιθέμενες πρωτεΐνες κατά την έξοδό τους από το ριβόσωμα. Μελετήθηκε η λειτουργία της Τ. thermophilus L4 και συγκεκριμένα του πιθανού ρόλου ενός συντηρημένου αμινοξέος, του Glu-56, στη δημιουργία του πεπτιδικού δεσμού και στη διέλευση της πεπτιδικής αλυσίδας από το κανάλι. Έγιναν μεταλλάξεις στο αμινοξύ αυτό όπως και στη γειτονική Gly-55 (Glu56Ala, Glu56Gln, Glu56Asp, Gly55Ala, Gly55Ser, Gly55Glu, Gly55Glu/Glu56Gly) κι ενσωμάτωση τόσο της αγρίου-τύπου L4 όσο και των μεταλλάξεων αυτής σε ριβοσώματα από κύτταρα E. coli. Τα ριβοσώματα αυτά ελέγχθηκαν ως προς την ενεργότητά τους στη δημιουργία του πεπτιδικού δεσμού με την αντίδραση της πουρομυκίνης. Από τα πειραματικά αποτελέσματα προέκυψε ότι η γ-καρβοξυλομάδα του γλουταμινικού οξέος-56 δεν εμπλέκεται άμεσα στην κατάλυση της δημιουργίας του πεπτιδικού δεσμού αλλά πιθανότατα έμμεσα μέσω διατάραξης της διαμόρφωσης του 23S rRNA η οποία έχει ως αποτέλεσμα "πιθανή απομάκρυνση" της αδενίνης A2451Ec (E. coli) από το κέντρο της πεπτιδυλικής τρανσφεράσης. Επίσης διαπιστώθηκε ότι το μέγεθος της ανθρακικής αλυσίδας του αμινοξέος στη θέση 56 παίζει σημαντικό ρόλο στις καταλυτικές ιδιότητες της πεπτιδυλικής τρανσφεράσης. Αναφορικά με το ρόλο της Gly-55 φαίνεται πως κι αυτός είναι έμμεσος και διαπιστώθηκε πώς είναι απαραίτητη η ύπαρξη αλανίνης στη θέση 55 για την εκδήλωση υψηλής καταλυτικής δραστικότητας στα E. coli κύτταρα. Η διερεύνηση της επίδρασης της L4 στην βιοσύνθεση των πεπτιδυλο-tRNA πεπτιδίων και στην διέλευσή τους από το κανάλι έγινε με πειράματα συζευγμένης μεταγραφής-μετάφρασης σε συστήματα ελεύθερα κυττάρων (S30 εκχυλίσματα). Τα συστήματα ελεύθερα κυττάρων περιείχαν ριβοσωμάτια με ενσωματωμένες τις διαφορετικές μορφές της L4 (αγρίου τύπου ή μεταλλάξεις αυτής) και χρησιμοποιήθηκαν για in vitro μεταγραφή-μετάφραση των πρωτεϊνών IF-1, IF-2, EF-G, Co και 5&6 απουσία και παρουσία του αντιβιοτικού ερυθρομυκίνη. Παρατηρήθηκε ότι ο ρυθμός και ο "τρόπος" βιοσύνθεσής των πρωτεϊνών μεταβάλλεται, όταν χρησιμοποιούνται διαφορετικές μεταλλάξεις της L4. Το γεγονός αυτό εισηγείται την ύπαρξη αλληλοεπιδράσεων μεταξύ των νεοσυντιθέμενων πεπτιδικών αλυσίδων και της L4, για την οποία είναι γνωστό ότι βρίσκεται πολύ κοντά στην είσοδο του καναλιού

Ribosomes containing mutants of L4 ribosomal protein from Thermus thermophilus display multiple defects in ribosomal functions and sensitivity against erythromycin

Protein L4 from Thermus thermophilus (TthL4) was heterologously overproduced in Escherichia coli cells. To study the implication of the extended loop of TthL4 in the exit-tunnel and peptidyltransferase functions, the highly conserved E56 was replaced by D or Q, while the semiconserved G55 was changed to E or S. Moreover, the sequence -G55E56- was inverted to -E55G56-. When we incorporated these mutants into E. coli ribosomes and investigated their impact on poly(Phe) synthesis, high variations in the synthetic activity and response to erythromycin of the resulting ribosomes were observed. In the absence of erythromycin, ribosomes harboring mutations G55E and E56D in TthL4 protein were characterized by low activity in synthesizing poly(Phe) and decreased capability in binding tRNA at the A site. On the other hand, ribosomes possessing mutations G55E, G55S, G55E-E56G, or E56Q in TthL4 protein were unexpectedly more sensitive to erythromycin. Evidence in support of these findings was drawn by in vivo experiments, assessing the erythromycin sensitivity of E. coli cells expressing wild-type or mutant TthL4 proteins. Our results emphasize the role of the extended loop of L4 ribosomal protein in the exit-tunnel and peptidyltransferase center functions