Superoxide dismutase activity in transgenic canola

Superoxide dismutase (SOD) activity was investigated in leaves of transgenic canola plants which expressed heterologous genes of different origin, namely 1—herbicide resistance genes (bar and simultaneously bar and epsps); 2—DesC desaturase gene (desC) of cyanobacterium Synechococcus vulcanus; 3—human interferon α2b gene (huIFN-α2b); 4—esxA::fbpBΔTMD fused gene, encoding ESAT-6 and Ag85b Mycobacterium tuberculosis proteins, inducing immune response against tuberculosis; 5—cyp11A1 gene of cytochrome P450SCC from bovine adrenal cortex mitochondria. Introduction of herbicide resistance genes as well as desaturase gene of cyanobacterium and mycobacterium’s genes did not change leaf SOD activity. At the same time it was shown that cyp11A1 and huIFN-α2b canola have increased leaf SOD activity up 58 and 33%, respectively, compared with control ones in non-stress conditions. It may be a prerequisite for improved resistance of these plants to the stressors of different origin.Исследована активность супероксиддисмутазы (СОД (в листьях трансгенных растений рапса, экспрессирующих гетерологичные гены различного происхождения, а именном: 1) гены устойчивости к гербицидам (bar и одновременно bar и epsps); 2) ген де-сатуразы DesC (desC) цианобактерии Synechococcus vulcanus; 3) ген α2b интерферона человека (huIFN-α2b); 4) слитый ген esxA::fbpBΔTMD, кодирующий белки ESAT-6 и Ag85b Mycobacterium tuberculosis, которые индуцируют иммунный ответ против туберкулеза; 5) ген cyp11A1 цитохрома P450SCC митохондрий коры надпочечников быка. Введение генов устойчивости к гербицидам, а также гена десатуразы цианобак-терии и генов микобактерии не изменяло активности СОД в листьях рапса. Вместе с тем показано, что в условиях без стресса у растений с трансгенами cyp11A1 и huIFN-α2b активность СОД повышена до 58 и 33 % соответственно в сравнении с контролем. Это может быть предпосылкой для увеличения их устойчивости к стрессорам различного происхождения.Досліджено активність супероксиддисмутази (СОД) в листках трансгенних рослин ріпаку, що експресують гетерологічні гени різного походження, а саме: 1) гени стійкості до гербіцидів (bar і одночасно bar і epsps); 2) ген десатурази DesC (desC) ціанобактерії Synechococcus vulcanus; 3) ген α2b інтерферона лю-дини (huIFN-α2b); 4) злитий ген esxA::fbpBΔTMD, що кодує білки ESAT-6 і Ag85b Mycobacterium tubercu-losis, які індукують імунну відповідь проти тубер-кульозу; 5) ген cyp11A1 цитохрома P450SCC міто-хондрій кори надниркових залоз великої рогатої худоби. Введення генів стійкості до гербіцидів, а також гена десатурази ціанобактерії та генів мікобактерії не змінювало активності СОД в листках ріпаку. Разом з тим встановлено, що у рослин з трансгенами cyp11A1 і huIFN-α2b в умовах без стресу активність СОД підвищена до 58 і 33 % відповідно в порівнянні з контролем. Це може бути передумовою для підвищення їхньої стійкості до стресорів різного походження

Plant biomass increase: recent advances in genetic engineering

Plant biomass enhancement using transgenesis in model as well as in crop plants both under optimal and stress controlled (greenhouse or growth chamber) and field conditions is observed. It was documented that genetic engineering approaches allow reaching up to two-fold increase of biomass in optimal conditions. Both transgenic and initial plants reduce biomass production under stress. It was demonstrated that it can be up to 2-fold increase in productivity of transgenic plant versus untransformed one in stress. Some heterologous gene expression features influencing plant biomass production are discussed.Вирішення завдань збільшення біомаси рослин з використанням трансгенезу роглянуто як на модельних об’ектах, так і на прикладах сільськогосподарських культур, вирощуваних за оптимальних і контрольованих стресових (теплиця або клімакамера) та польових умов. Показано, що генно-інженерні підходи дозволяють досягти подвоєння біомаси за оптимальних умов. І трансгенні, і вихідні рослини зменшують накопичення біомаси внаслідок дії стресових факторів. Продемонстровано, що трансгенні рослини здатні збільшувати свою продуктивність до двох разів порівняно з нетрансформованими за умов стресу. Обговорюються деякі особливості гетерологічної експресії генів, які впливають на накопичення біомаси.Решение задачи увеличения биомассы растений с использованием трансгенеза рассмотрено как на модельных объектах, так и на примерах сельскохозяйственных культур, выращиваемых в оптимальных и контролируемых стрессовых (теплица или климакамера), а также полевых условиях. Показано, что генно-инженерные подходы позволяют достичь удвоения биомассы при оптимальных условиях. И трансгенные, и исходные растения уменьшают накопление биомассы в результате действия стрессовых факторов. Продемонстрировано, что в условиях стресса трансгенные растения способны увеличивать свою продуктивность до двух раз по сравнению с нетрансформированными. Обсуждаются некоторые особенности гетерологической экспрессии генов, влияющие на накопление биомассы

cyp11A1 canola plants under short time heat stress conditions

In order to investigate the high temperature tolerance of spring canola plants (Brassica napus L.) constitutively expressing cyp11A1 gene which encodes bovine cytochrome P450SCC the growth features were analyzed under short time heat stress (42°C) in growth chamber. Earlier it was documented that results of the heat tolerance test positively correlated with improvement of high temperature resistance in field trial. Higher relative water content (by 13%) and superoxide dismutase (SOD) activity, lower electrolyte leakage (up 1.4-fold) and smaller increase in chlorophyll a and carotenoid contents in cyp11A1 canola leaves in comparison with wild-type plants under stress allowed to conclude cyp11A1 plants are more tolerant to high temperature than the control ones. We suppose that SOD activity increase which revealed in our transgenic canola in normal condition plays the defining role in the biochemical alterations in plant metabolism for the thermotolerance improvement. SOD activity increment could be caused by heterologous cytochrome P450SCC activity which resulted in the superoxide radical formation. Cyp11A1 canola plants might be resistant to the other stress conditions of different origin.Для исследования устойчивости трансгенных растений ярового рапса (Brassica napus L.), конститутивно экспрессирующих ген cyp11A1, который кодирует цитохром P450SCC быка, к высоким температурам были проанализированы особенности роста в условиях кратковременного высокотемпературного стресса (42 ºС) в климакамере. Результаты этого теста положительно коррелируют с повышением толерантности к действию высоких температур в полевых испытаниях. Увеличение относительного содержания воды (на 13 %) и активности супероксиддисмутазы (СОД) пониженный выход электролитов (в 1,4 раза) и меньшее повышение содержания хлорофилла a и каротиноидов в листьях трансгенных растений по сравнению с растениями дикого типа в условиях высокотемпературного стресса позволяют сделать вывод о том, что термоустойчивость cyp11A1 растений рапса выше, чем контрольных. Увеличение активности СОД, обнаруженное в наших трансгенных растениях рапса в нормальных условиях, играет предположительно определяющую роль в биохимических изменениях растительного метаболизма, что приводит к возрастанию устойчивости к повышенным температурам. Возрастание активности СОД возможно за счет экспрессии гетероло-гического цитохрома P450SCC, которая приводит к образованию супероксид радикалов. Полученные растения могут быть устойчивы к другим стрессовым воздействиям различного происхождения.Для вивчення стійкості трансгенних рослин ярого ріпаку (Brassica napus L.), які конститутивно експресують ген cyp11A1, що кодує цитохром P450SCC великої рогатої худоби, до дії високих температур проаналізовано особливості росту за умов коротко-тривалого високотемпературного стресу (42 ºС) вклімакамері. Результати цього тесту позитивно корелюють з підвищенням толерантності до дії високих температур в польових дослідах. На підставі збільшеного відносного вмісту води (на 13%) і підвищеної активності СОД, а також зменшеного виходу електролітів (в 1,4 раза) і меншого підвищення вмісту хлорофілу a і каротиноїдів в листках трансгенних рослин у порівнянні з рослинами дикого типу за умов стресу можна зробити висновок про підвищення термостійкості у рослин ріпаку з трансгеном cyp11A1 порівняно з контролем. Збільшення активності СОД в наших трансгенних рослинах ріпаку, виявлене за нормальних умов, відіграє визначальну роль у біохімічних змінах рослинного метаболізму, що спричиняє зростання стійкості до підвищених температур. Зростання активності СОД можливо за рахунок активності цитохрому P450SCC, в результаті якої відбувається утворення супероксид радикалів. Отримані рослини можуть бути стійкими до інших стресових впливів різного походження

Multiplex PCR assay for detection of human interferon alpha2b gene in transgenic plants

During the last decade interferons are regarded as potent candidates for generation of plant-based edible vaccines because of broad spectrum of antiviral activities and adjuvant properties. Establishment and certification of numerous interferon producing plant systems requests development of fast and efficient multiplex PCR protocol for the transgene detection in GM plants. Here we represent a protocol for simultaneous amplification in one assay of fragments of hIFN alpha 2b gene and two control genes, namely virD1 of Agrobacterium tumefaciens and conservative region of plant actin gene.В последнее десятилетие интерфероны рассматриваются как перспективные кандидаты для получения из растений в виде съедобных вакцин, поскольку обладают широким спектром антивирусной активности и адъювантными свойствами. Создание и сертификация многочисленных растительных систем, продуцирующих рекомбинантный интерферон, делают актуальной разработку быстрого и эффективного протокола мультиплексной ПЦР для определения данного трансгена в генетически модифицированных растениях. В настоящей публикации мы приводим метод детекции гена человеческого интерферона альфа-2b в трансгенных растениях с помощью совместной амплификации в ходе одной реакции фрагментов гена hINTα2b и двух контрольных генов, virD1 Agrobacterium tumefaciens и консервативного участка гена актина растений.В останнє десятиліття інтерферони розглядаються як перспективні кандидати для отримання з рослин у вигляді їстівних вакцин оскільки, вони мають широкий спектр антивірусної активності й ад’ювантні властивості. Створення і сертифікація численних рослинних систем, які накопичують рекомбінантний інтерферон, роблять актуальною розробку швидкого й ефективного протоколу мультиплексної ПЛР для визначення даного трансгена в генетично модифікованих рослинах. В цій публікації ми наводимо метод детекції гена людського інтерферону альфа-2b у трансгенних рослинах за допомогою сумісної ампліфікації в ході однієї реакції фрагментів гена hINTα2b і двох контрольних генів, virD1 Agrobacterium tumefaciens і консервативної ділянки гена актину рослин

Creation of transgenic Brassica napus L. plants expressing human alpha 2b interferon gene

Spring rapeseed transgenic lines expressing human interferon alpha 2b were created by Agrobacteriummediated transformation of aseptic plant leaf explants. The maximum antiviral activity of the leaf extracts reached 4500 IU/g fresh weight. It was determined that the antioxidant activity and the activity of an enzyme of plant antioxidant system – superoxide dismutase (SOD) – in the leaf tissues of transgenic plants increased compared to controls. There were no correlations between the interferon and antioxidant activities, as well as between SOD and interferon activities. Using the obtained transgenic rapeseed plants with high interferon and antioxidant activities as a feed additive for animals might have preventive effect on their body, increasing resistance to infections of various origins.Методом агробактериальной трансформации листовых эксплантов асептических растений ярового рапса получены линии, экспрессирующие альфа 2b интерферон человека. Максимальная противо-вирусная активность экстрактов листьев достигала 4500 МЕ/сырого веса. Установлено, что антиоксидантная активность и активность одного из ферментов антиоксидантной системы растений – супероксиддисмутазы (СОД) – в тканях листьев трансгенных растений повышена по сравнению с контрольными. Не выявлено корреляции как между активностью интерферона и антиоксидантной активностью, так и между активностью интерферона и активностью СОД. Использование полученных трансгенных растений рапса с высокой активностью интерферона и повышенной антиоксидантной активностью как добавки к кормам животных могло бы оказывать профилактическое влияние на их организм, повышая устойчивость к различным инфекциям.Методом агробактеріальної трансформації листових експлантів асептичних рослин ярого ріпака отримано лінії, що експресують альфа 2b інтерферон людини. Максимальна противірусна активність екстрактів листків сягала 4500 МО/сирої ваги. Встановлено, що антиоксидантна активність і активність одного з ферментів антиоксидантної системи рослин – супероксиддисмутази (СОД) – в тканинах листків трансгенних рослин підвищена в порівнянні з контрольними. Не виявлено кореляції ні між активністю інтерферона і антиоксидантною активністю, ні між активністю інтерферона і активністю СОД. Використання отриманих трансгенних рослин ріпака з високою активністю інтерферона та підвищеною антиоксидантною активністю як добавки до кормів тварин мало б профілактично впливати на їхній організм, підвищуючи стійкість до інфекцій різного походження

Creation of glyphosate-resistant Brassica napus L. plants expressing DesC desaturase of cyanobacterium Synechococcus vulcanus

Aim. Creation of glyphosate-resistant canola plants expressing bifunctional hybrid desC::licBM3 gene. In the hybrid gene the sequence of DesC desaturase of cyanobacterium S. vulcanus without plastid targeting was fused with the sequence of thermostable lichenase reporter LicBM3 gene. Methods. Agrobacterium tumefaciensmediated transformation, PCR, quantitative and qualitative determination of lichenase activity, genetic analysis. Results. Transgenic canola plants, carring the enolpyruvat shikimat phosphate syntase gene (epsps), conferring on plants resistance to phosphonomethyl glycine herbicides (Roundup), as well as the desC::licBM3 gene, were selected. The presence of transgenes was confimed by multiplex PCR. The epsps gene expression in canola was shown at the transcription level, during in vitro growth and after greenhouse herbicide treatment. Activity of the licBM3 gene product as a part of hybrid protein allowed quantitative and qualiative estimation of the desaturase gene expression. Inheritance of heterologous genes and their expression in the first generation were investigated. Conclusions. Transgenic canola plants were obtained, the presence of trangenes in plant genome was proved and expression of the target genes was detected. Keywords: Brassica napus, desC, epsps, licBM3, lichenase.Цель. Создание растений рапса, устойчивых к глифосату и экспрессирующих бифункциональный гибридный ген desC::licBM3, в котором последовательность десатуразы DesC цианобактерии S. vulcanus без сигнала транспорта в пластиды слита с последовательностью гена репортерного белка термостабильной лихеназы LicB Clostridium thermocellum. Методы. Agrobacterium tumefaciens-опосредованная трансформация, ПЦР, качественное и количественное определение активности термостабильной лихеназы, генетический анализ. Результаты. Получены трансгенные растения рапса, несущие два целевых гена: енолпируватшикиматфосфатсинтазы (epsps), обеспечивающего устойчивость растений к гербицидам на основе фосфонометилглицина, и гена desC::licBM3. Присутствие трансгенов в геноме растений доказано методом мультиплексной ПЦР. Экспрессия гена epsps показана на уровне транскрипции, в условиях in vitro и in vivo (теплицa). Наличие продукта гена licBM3 в составе гибридного белка позволило оценить экспрессию слитого с ним гена десатуразы. Прослежено наследование введенных генов и их экспрессия в первом поколении. Выводы. Получены линии трансгенных растений рапса, подтверждено присутствие трансгенов в геноме растений и доказана экспрессия целевых генов. Ключевые слова: Brassica napus, epsps, desC, licBM3, лихеназа.Мета. Створення стійких до гербіциду Roundup рослин ріпаку, що експресують біфункціональний гібридний ген desC::licBM3, в якому послідовність десатурази DesC ціанобактерії S. vulcanus без сигналу транспорту в пластиди злита з послідовністю гена репортерного білка ліхенази LicBM3 Clostridium thermocellum. Методи. Agrobacterium tumefaciens-опосередкована трансформація, ПЛР, якісне і кількісне визначення активності термостабільної ліхенази, генетичний аналіз. Результати. Отримано трансгенні рослини ріпаку, які несуть два цільових гени: єнолпіруватшикі- матфосфатсинтази (epsps), що забезпечує стійкість рослин до гербіцидів на основі фосфонометилгліцину, і гена desC::licBM3. Присутність трансгенів у геномі рослин підтверджено методом мультиплексної ПЛР. Експресію гена epsps показано на рівні транскрипціі, за умов in vitro та in vivo (теплиця). Наявність продукту гена licBM3 у складі гібридного білка дозволила оцінити експресію злитого з ним гена десатурази. Простежено успадкування введених генів і їхня експресія в першому поколінні. Висновки. Отримано лінії трансгенних рослин ріпаку, підтверджено присутність трансгенів у геномі рослин і доведено експресію цільових генів. Ключові слова: Brassica napus, epsps, desC, licBM3, ліхеназа

Seed interferon imbibition leads seedling growth enhancement accompanying by increase in superoxide dismutase activity

Aim. We studied canola (Brassica napus cv Lega) in vitro seedling growth after seed imbibition by human recombinant interferon alpha 2b (INF) produced in bacteria. Methods. Germination, seedling fresh weight (FW), total soluble protein (TSP), and superoxide dismutase activity (SOD) measurements were conducted. Results. INF applications did not improve canola seed germination. TSP was not affected in cotyledons and decreased in hypocotyls. Seedling FW was increased by 100% (10² IU/ml INF), 140% (10³ IU/ml INF), and 70% (10⁴ IU/ml INF) in comparison with controls (treatments by pure water, or INF after boiling, or INF with diethyldithiocarbamate) under growth in thermostat at 24°. Differences in seedling FW were due to differences in hypocotyl and root FWs. SOD activity increased up to 2.18-fold in cotyledons and 1.47-fold in hypocotyls. Conclusions. Human recombinant INF alpha 2b application caused an dose-dependent increase of canola seedling biomass (up to 2.4-fold) during in vitro growth. SOD activity rise and its positive correlation to FW accumulation were detected in these seedlings. We suppose SOD activity increment which occurred due to seed INF imbibition improved plant growth. Key words: canola, fresh weight, interferon, superoxide dismutase activity

Alterations in superoxide dismutase activity due to heterologous gene expression: plant peculiarities

Aims. The analysis of the information about the features of transgenic plants bearing some genes which influenced on the activity of one from enzymes of plant antioxidant defence, namely superoxide dismutase, was the aim. Results. The review presents and summarizes the literature and own data reflecting physiological, biochemical and molecular biological parameters of plants possessing higher or lower superoxide dismutase activity due to transgenesis. Conclusions. Transgenic plants having the increased SOD activity would demonstrate no phenotype changes under favourable conditions (or these changes have not been studied). But often they produced larger biomass and were characterized by higher vegetative growth rate, higher total soluble protein and changed chlorophyll content in comparison with wild type ones and/or transgenic plants bearing only empty vector. For most of them the improved tolerance to stresses of different origin has been proved in laboratory and field trials. Biotechnological plants characterizing by increased SOD activity in non-stressed conditions may have higher adaptive capacity compared ones possessing lowered SOD activity. Keywords: SOD activity, transgenic plants, favourable conditions, stress

Creation of transgenic Brassica napus L. Plants expressing human alpha 2b interferon gene

Spring rapeseed transgenic lines expressing human interferon alpha 2b were created by Agrobacteriummediated transformation of aseptic plant leaf explants. The maximum antiviral activity of the leaf extracts reached 4500 IU/g fresh weight. It was determined that the antioxidant activity and the activity of an enzyme of plant antioxidant system – superoxide dismutase (SOD) – in the leaf tissues of transgenic plants increased compared to controls. There were no correlations between the interferon and antioxidant activities, as well as between SOD and interferon activities. Using the obtained transgenic rapeseed plants with high interferon and antioxidant activities as a feed additive for animals might have preventive effect on their body, increasing resistance to infections of various origins.Методом агробактериальной трансформации листовых эксплантов асептических растений ярового рапса получены линии, экспрессирующие альфа 2b интерферон человека. Максимальная противо-вирусная активность экстрактов листьев достигала 4500 МЕ/сырого веса. Установлено, что антиоксидантная активность и активность одного из ферментов антиоксидантной системы растений – супероксиддисмутазы (СОД) – в тканях листьев трансгенных растений повышена по сравнению с контрольными. Не выявлено корреляции как между активностью интерферона и антиоксидантной активностью, так и между активностью интерферона и активностью СОД. Использование полученных трансгенных растений рапса с высокой активностью интерферона и повышенной антиоксидантной активностью как добавки к кормам животных могло бы оказывать профилактическое влияние на их организм, повышая устойчивость к различным инфекциям.Методом агробактеріальної трансформації листових експлантів асептичних рослин ярого ріпака отримано лінії, що експресують альфа 2b інтерферон людини. Максимальна противірусна активність екстрактів листків сягала 4500 МО/сирої ваги. Встановлено, що антиоксидантна активність і активність одного з ферментів антиоксидантної системи рослин – супероксиддисмутази (СОД) – в тканинах листків трансгенних рослин підвищена в порівнянні з контрольними. Не виявлено кореляції ні між активністю інтерферона і антиоксидантною активністю, ні між активністю інтерферона і активністю СОД. Використання отриманих трансгенних рослин ріпака з високою активністю інтерферона та підвищеною антиоксидантною активністю як добавки до кормів тварин мало б профілактично впливати на їхній організм, підвищуючи стійкість до інфекцій різного походження