Cell therapy of heart pathologies

The review article is devoted to cellular cardiomyoplasty as a novel technology of treatment of cardiac insufficiency. The experiments on animals and the first clinical trials have shown the possibility to improve the contractile function of diseased heart after transplantation of different types of donor cells: ardiomyocytes, bone marrow enriched by hematopoietic stem cells and mesenchymal stem cells. The problems of cellular cardiomyoplasty are discussed.Оглядова стаття присвячена клітинній кардіоміопластиці як новій технології лікування серцевої недостатності. Експерименти на тваринах і перші клінічні випробування показали можливість поліпшення скорочувальної функції ураженого міокарда після трансплантації різних типів клітин: кардіоміоцитів, кісткового мозку, збагаченого гемопоетичними стовбуровими клітинами, а також мезенхімальних стовбурових клітин. Обговорюються проблеми клітинної кардіоміопластики.Обзорная статья посвящена клеточной кардиомиопластике как новой технологии лечения сердечной недостаточности. Эксперименты на животных и первые клинические испытания новой технологии показали возможность улучшения сократительной функции пораженного миокарда после трансплантации различных типов клеток: кардиомиоцитов, костного мозга, обогащенного гемопоэтическими стволовыми клетками, а также мезенхимальных стволовых клеток. Обсуждаются проблемы клеточной кардиомиопластики

Different types of biotechnological wound coverages created with the application of alive human cells

Currently, the development and the implementation of the new biotechnological wound coverings (skin equivalents) designed for temporal or permanent replacement of damaged or destroyed areas of human skin remains extremely actual relevant in clinical practice. Skin equivalents or equivalents of individual skin layers which include alive cells of different types take a special place among the artificial wound coverings. They mostly contain two basic types of cells – fibroblasts and keratinocytes (together or separately). Such bioconstructions are usually served as temporary coverings, which supply the damaged skin by biologically active substances and stimulate the regeneration of the patient's own tissues. In this review we consider as commercially available wound coverings and those which are still studied in the laboratories. Until now ideal substitutes of natural skin have not yet created, so the efforts of many researchers are focusing on the solution of this problem.В нинішній час залишається надзвичайно актуальною розробка та впровадження в клінічну практику нових біотехнологічних ранових покриттів (еквівалентів шкіри), призначених тимчасово або постійно замінювати пошкоджені або зруйновані ділянки шкіри людини. Серед штучних ранових покриттів особливе місце займають еквіваленти шкіри або її окремих шарів, що містять у своєму складі живі клітини різних типів та походження. До складу біоконструкцій найчастіше входять два основних типи клітин – фібробласти і кератиноцити (спільно або окремо). Такі біоконструкцій застосовують, зазвичай, як тимчасові покриття, що забезпечують пошкоджену шкіру біологічно активними речовинами і стимулюють регенерацію власних тканин пацієнта. У огляді розглядаються як комерційно доступні раневі покриття, так і такі, які ще досліджуються в лабораторіях. Донині ще не створено ідеальних замінників шкіри, тому зусилля багатьох дослідників спрямовані на вирішення цього завдання.В настоящее время остаётся чрезвычайно актуальной разработка и внедрение в клиническую практику новых биотехнологических раневых покрытий (эквивалентов кожи), призванных временно или постоянно заменять повреждённые или разрушенные участки кожи человека. Среди искусственных раневых покрытий особое место занимают эквиваленты кожи или её отдельных слоёв, имеющие в своём составе живые клетки различных типов и происхождения. В состав биоконструкций чаще всего входят два основных типа клеток – фибробласты и кератиноциты (совместно или отдельно). Такие биоконструкции служат, как правило, в качестве временных покрытий, которые снабжают поврежденную кожу биологически активными веществами и стимулируют регенерацию собственных тканей пациента. В обзоре рассматриваются как коммерчески доступные раневые покрытия, так и те, которые ещё исследуются в лабораториях. До настоящего времени ещё не созданы идеальные заменители кожи, поэтому усилия многих исследователей направлены на решение этой задачи

Isolectins of phytohemagglutinin are able to induce apoptosis in HEp-2 carcinoma cells in vitro

Aim: To study the effects of total phytohemagglutinin (PHA) and its isolectins on cell death and apoptosis in human HEp-2 carcinoma cells and to analyze the possible molecular mechanisms of lectin induced apoptosis. Materials and Methods: The commercial preparation of the kidney beans (Phaseolus vulgaris) lectins and HEp-2 cells were used. Apoptosis index was determined using acridine orange and ethidium bromide staining. The expression levels of apoptosis mediator cleaved caspase-3 and proapoptotic Bax protein were studied by Western blot analysis. The gene expression levels were analyzed by qPCR. Results: PHA and its isolectins induced apoptosis in HEp-2 cells accompanied by the increased expression of caspase-3 cleaved form, with PHA-E being the most effective. The treatment of HEp-2 cells with PHA or its isolectins resulted in a marked increase of Bax on both mRNA and protein levels. Conclusions: PHA and its isolectins were shown to induce the apoptosis in human HEp-2 carcinoma cells via increasing proapoptotic protein Bax and activating caspases-3. Key Words: phytohemagglutinin, isolectins, apoptosis, caspase-3, Bax

Embryonically induced β-catenin haploinsufficiency attenuates postnatal heart development and causes violation of foetal genes program

The β-catenin role in myocardium remodeling and hypertrophy development is the subject of numerous and controversial investigations. Aim. To investigate the significance of cardiac ablation of β-catenin for heart development using conditional knockout approach. Methods. Standard histological techniques (HE- and MT-staining) and quantitative RT-PCR were used. Results. Our data demonstrate that β-catenin haploinsufficiency in heart provokes upregulation of foetal genes program without visible morphological abnormalities comparing to control groups of animals of the same age. Conclusions. Our data demonstrate that experimental conditions in this study provoke the delay in the development and growth of adult heart without visible morphological abnormalities.Роль білка β-катеніну у перебудовах міокарду і розвитку його гі- пертрофії на сьогодні є предметом численних і часто суперечливих досліджень. Мета. Вивчити вплив кардіоспецифічного зниження рівня експресії гена β-катеніну на розвиток серця на моделі умовно-нокаутних тварин. Методи. Використано стандартні гістологічні (гематоксилін-еозинове і трихромне забарвлення) та зворотно-транскриптазну ПЛР у реальному часі. Результати. Проаналізовано вплив нестачі одного алеля гена β-катеніну на постнатальний розвиток і формування дорослого органа. Відмічено зростання рівня експресії фетальних генів у тварин усіх вікових груп за умови нестачі одного алеля гена β-катеніну. Висновки. Отримані дані свідчать про те, що досліджуваний нами стан спричиняє затримку розвитку і росту дорослого серця, проте без жодних ознак морфологічних відхилень порівняно з контрольними тваринами відповідних вікових груп.Роль белка β-катенина в перестройках миокарда и развитии его гипертрофии на сегодняшний день является предметом упорных и зачастую противоречивых исследований. Цель. Изучить влияние кардиоспецифического снижения уровня экспрессии гена β-катенина на развитие сердца на модели условно-нокаутных животных. Методы. Использованы стандартные гистологические методы (гематоксилин-эозиновое и трихромное окрашивание) и обратно-транскриптазную ПЦР в реальном времени. Результаты. Проанализировано влияние недостатка одного аллеля гена β-катенина на постнатальное развитие и формирование взрослого органа. Отмечено повышение уровня экспрессии фетальных генов во всех возрастных группах животных при условии недостатка одного аллеля гена β-катенина. Выводы. Полученные данные показывают, что исследованное нами состояние вызывает задержку развития и роста взрослого сердца, впрочем без каких-либо признаков морфологических отклонений по сравнению с контрольными животными соответствующих возрастных групп

DNA loop organization in glioblastoma T98G cells at their different functional states

The loop domain organization of chromatin, which plays an important role in transcription regulation, may depend on the cell functional state. Aim. To investigate DNA loop reorganization upon functional transitions in the glioblastoma T98G cells. Methods. Single cell gel electrophoresis (a comet assay) was used to analyze the kinetics of the DNA loop migration from the nucleoids obtained from the lysed cells. Results. The cells arrested in the G1 phase of the cell cycle were characterized by a relatively low amount of DNA in the comet tails due to a low content of DNA in the loops which may be resolved by the comet assay (up to ~300 kb). After cell reactivation, the contour length of the loops essentially increased in parallel with a decrease in the linear loop density along the genome. Conclusions. An increase in the loop size and a respective decrease in the loop density may be a general feature of activated cells as we earlier observed similar effects upon activation of human lymphocytes.Організація петельних доменів хроматину, яка відіграє важливу роль у регуляції транскрипції, напевно може залежати від функціонального стану клітини. Мета. Дослідити можливу реорганізацію петель ДНК при функціональних переходах у гліобластомних клітинах T98G. Методи. Ми застосовували метод електрофорезу ДНК ізольованих клітин (кометний електрофорез) для аналізу кінетики міграції петель ДНК з нуклеоїдів, отриманих з лізованих клітин. Результати. Клітини, заарештовані на фазі G1 клітинного циклу, характеризуються порівняно низьким вмістом ДНК у хвостах комет внаслідок низького вмісту ДНК у складі петель, що знаходяться у межах роздільної здатності кометного електрофорезу (до ~300 кб). Після реактивації клітин контурна довжина петель суттєво зростає, паралельно зі зниженням лінійної щільності петель уздовж геному. Висновки. Оскільки подібні ефекти спостерігались нами раніше для активованих лімфоцитів, ми робимо висновок, що зростання розміру петель та відповідне зниження їхньої лінійної щільності може бути загальною характеристикою активованих клітин.Организация петельных доменов хроматина, играющая важную роль в регуляции транскрипции, предположительно может зависеть от функционального состояния клетки. Цель. Исследовать возможной реорганизации петель ДНК при функциональных переходах в глиобластомных клетках T98G. Методы. Мы использовали электрофорез ДНК изолированных клеток (кометный электрофорез) для анализа кинетики миграции петель ДНК из нуклеоидов, полученных из лизированных клеток. Результаты. Клетки, арестованные на фазе G1 клеточного цикла, характеризуются сравнительно низким содержанием ДНК в хвостах комет из-за низкого содержания ДНК в составе петель, которые находятся в пределах разрешающей способности кометного электрофореза (до ~300 кб). После реактивации клеток контурная длина петель существенно возрастает, параллельно со снижением линейной плотности петель вдоль генома. Выводы. Поскольку аналогичные эффекты наблюдались нами ранее для активированных лимфоцитов, мы заключили, что возрастание размера петель и соответствующее снижение их линейной плотности может быть общей характеристикой активированных клеток

Influence of some biologically active substances on amount of MGMT and MARP proteins in human cells in vitro

Aim. To investigate an effect of biologically active compounds IFN-α2b, EMAPII, Card medium, fibronectin on the amount of MGMT (O6-methylguanine-DNA methyltransferase) and MARP (anti-Methyltransferase Antibody Recognizable Protein) proteins in human cells in vitro. Methods. The human cells of 4BL, Hep-2 and A102 lines were treated with growth factors and cytokines. Changes in the amount of MGMT and MARP proteins were studied by Western blot analysis with anti-MGMT mAbs. Results. The treatment of A102 cells with EMAPII, fibronectin, Laferon and Card medium led to a decreased level of the MGMT protein, whereas the amount of MARP was highly increased in these cells. The treatment with the recombinant protein IFN-α2b increased the amount of MGMT and MARP proteins in Hep-2 cells. The treatment with extracts of transgenic plants,containing human IFN-α2b, caused a significant decrease in the content of both proteins in Hep-2 cells and MARP in 4BL cells. Conclusions. Both MGMT and MARP are highly inducible proteins. Their amount in cells can be changed by some growth factors (Card medium, fibronectin), cytokine (IFN-α2b), cytokine-like (EMAPII) or cytokine-containing substances (Laferon and IFN-α2b in plant extracts). This regulation depended not only on the type of biologically active substances but on the cell line used in this study as well.Мета. Дослідження впливу біологічно активних сполук IFN-α2b, EMAPII, середовища Card і фібронектину на вміст білків MGMT (О6-метилгуанін-ДНК метилтрансфераза) і MARP (білок, що розпізнається анти-MGMT антитілами) у клітинах людини in vitro. Методи. Клітини людини ліній 4BL, Hep-2 і A102 обробляли ростовими факторами і цитокінами. Зміни в кількості білків MGMT і MARP досліджували з використанням Вестерн блот аналізу і моноклональних анти-MGMT антитіл. Результати. Обробка клітин A102 препаратами EMAPII, фібронектину і Лаферону призводить до зниження кількості білка MGMT на фоні значного зростання кількості білка MARP у цих клітинах. Обробка рекомбінантним білком IFN-α2b підвищує кількість білків MGMT і MARP у клітинах Hep-2, а екстрактами трансгенних рослин, які містять IFN-α2b людини, – зменшує кількість обох білків у клітинах Hep-2 та білка MARP у клітинах 4BL. Висновки. MGMT і MARP є високо-індуцибельними білками. Їхня кількість може варіювати під дією деяких ростових факторів (середовище Card і фібронектин), цитокіну (IFN-α2b), цитокіноподібного (EMAPII) та цитокіновмісних (Лаферон і IFN-α2b у композиції з рослинними екстрактами) препаратів. Виявлена регуляція залежить не лише від типу біологічно активних речовин, але й від клітинних ліній, використаних в експериментах.Цель. Исследовать влияние биологически активных соединений IFN-α2b, EMAP II, среды Card и фибронектина на содержание белков MGMT (О6-метилгуанин-ДНК метилтрансфераза) и MARP (белок, распознаваемый анти-MGMT антителами) в клетках человека in vitro. Методы. Клетки человека линий 4BL, Hep-2 и A102 обрабатывали ростовыми факторами и цитокинами. Изменения в количестве белков MGMT и MARP исследовали с использованием Вестерн блот анализа и моноклональных анти-MGMT антител. Результаты. Обработка клеток А102 препаратами EMAPII, фибронектина, Лаферона и среды Card снижает количество белка MGMT на фоне значительного возрастания количества белка MARP в этих клетках. Обработка рекомбинантным белком IFN-α2b увеличивает количество белков MGMT и MARP в клетках Hep-2, а экстрактами трансгенных растений, содержащих человеческий IFN-α2b, – существенно снижает количество обоих белков в клетках Hep-2 и MARP в клетках 4BL. Выводы. MGMT и MARP являются высокоиндуцибельными белками. Их количество может варьировать под действием некоторых ростовых факторов (среда Card и фибронектин), цитокина (IFN-α2b) цитокиноподобного (EMAP II) и цитокинсодержащих (Лаферон и IFN-α2b в композиции с растительными экстрактами) препаратов. Выявленная регуляция зависит не только от типа биологически активных веществ, но и от клеточных линий, использованных в экспериментах

Influence of EMAP II, IFN-α2b and its medicinal preparations on the MGMT protein amount in human cells in vitro

Aim. To study the effect of EMAP II, IFN-α2b and its medicinal preparations on the amount of O6-methylguanine-DNA methyltransferase (MGMT) protein in human cells in vitro. Methods. The human cells of 4BL and Hep-2 lines were treated with the purified recombinant proteins EMAP II, IFN-α2b and its commercial me dicinal preparations. Changes in the MGMT gene expression were studied at a protein level by Western blot analysis. Results. Treatment of Hep-2 and 4BL cells with EMAP II at the concentrations of 0.02 mg/ml and 2 mg/ml respectively led to induction of the MGMT gene expression. EMAP II at the concentrations of 0.2–20 g/ml caused decrease of the MGMT protein amount in Hep-2 cells. The regulating activity of EMAP II was also observed for MARP (anti-Methyltransferase Antibody Recognizable Protein). IFN-α2b and Laferon-PharmBiotek with the activity of 200 and 2000 IU/ml were shown to cause an increase of the MGMT protein amount in Hep-2 cells. Conclusions. The purified recombinant proteins EMAP II and IFN-α2b which are substrates for the medicinal preparations influenced on the amount of MGMT protein in the human cell cultures in a concentration-dependent manner. At the same time the effect of medicinal preparations differs from that of the purified protein IFN-α2b. Possibly it depends on the presence of stabilizing components in their compositions.Мета. Дослідити вплив EMAP II, IFN-α2b та його медичних препаратів на кількість білка MGMT у клітинах людини in vitro. Методи. Клітини людини 4BL і Hep-2 обробляли EMAP II, IFN-α2b і його комерційними препаратами. Зміни в експресії гена MGMT на рівні білка досліджували за використання Вестерн-блот аналізу. Результати. Обробка клітин Hep-2 і 4BL цитокіном EMAP II в концентрації 0,02 і 2 мкг/мл відповідно призводить до індукції експресії гена MGMT. EMAP II в концентраціях 0,2–20 мкг/мл знижує кількість білка MGMT у клітинах Hep-2. Регулювальну активність EMAP II спостерігали також і відносно MARP (білка, який розпізнається моноклональними анти-MGMT антитілами). Показано, що IFN-α2b і Лаферон-ФармБіотек з активністю 200 і 2000 МО/мл підвищують кількість білка MGMT у клітинах Hep-2. Висновки. Очищені рекомбінантні білки EMAP II і IFN-α2b, які є субстратами для медичних препаратів, впливають на кількість білка MGMT у клітинах людини in vitro залежно від концентрації. У той же час дія медичних препаратів відрізняється від ефекту очищеного білка IFN-α2b, що, можливо, пов’язано з присутністю стабілізувальних компонентів у його складі.Цель. Исследовать влияние EMAP II, IFN-α2b и его медицинских препаратов на количество белка MGMT в клетках человека in vitro. Методы. Клетки человека 4BL и Hep-2 обрабатывали EMAP II, IFN-α2b и его коммерческими препаратами. Изменения в экспрессии гена MGMT исследовали с использованием Вестерн-блот анализа. Результаты. Обработка клеток Hep-2 и 4BL цитокином EMAP II в концентрации 0,02 и 2 мкг/мл соответственно приводит к индукции экспрессии гена MGMT. EMAP II в концентрациях 0,2–20 мкг/мл снижает уровень экспрессии гена MGMT в клетках Hep-2. Регулирующую активность EMAP II наблюдали также и относительно MARP (белка, распознаваемого моноклональными анти-MGMT антителами). Показано, что IFN-α2b и Лаферон-ФармБиотек с активностью 200 и 2000 МЕ/мл повышают количество белка MGMT в клетках Hep-2. Выводы. Очищенные рекомбинантные белки EMAP II и IFN-α2b, являющиеся субстратами для медицинских препаратов, влияют на количество белка MGMT в клетках человека in vitro зависимым от концентрации образом. В то же время действие медицинских препаратов отличается от влияния очищенного белка IFN-α2b, что, возможно, связано с присутствием стабилизирующих компонентов в его составе

Correlation of mutagenesis level with expression of reparative enzyme O6-methylguanine DNA methyltransferase during establishment of cell lines in vitro

Long-term cultivation of cell lines inevitably leads to genetic and epigenetic changes. The aim of this work was a comparative analysis of karyotype and level of the expression of reparative enzyme O6-methylguanine-DNA- methyltransferase (MGMT) at different stages of establishment and stabilization of human cell line 4BL and cell line of mouse germ cells G1. Methods. The set of methods was used to research the dynamics of karyotypes changes: the differential staining of chromosomes, FISH-method and comparative genomic hybridization. The level of MGMT expression was analyzed by PCR reaction and Western blot analysis. Results. General trends of establishment of mouse and human cell lines were revealed: at the first stage, which is characterized by increased structural instability of the genome, an increase in the MGMT expression was revealed while at the second stage of stabilization – a decrease in the expression. Therefore, almost complete disappearance of MGMT protein in unmodified form (24 kDa) is observed. Conclusions. Statistically significant correlation between MGMT repair enzyme and mutations induction processes during mammalian cell adaptation and cell line establishment to in vitro was described.Тривале культивування клітинних ліній неминуче призводить до виникнення генетичних та епігенетичних змін. Мета. Порівняльний аналіз каріотипу і рівня експресії репаративного ферменту О6-метилгуанін-ДНК метилтрансферази (MGMT) на різних етапах становлення та стабілізації клітинної лінії людини 4BL і лінії ембріональних гермінативних клітин миші G1. Методи. Зміни каріотипу в динаміці досліджували, використовуючи диференційне забарвлення хромосом, FISH-метод і порівняльну геномну гібридизацію. Ген MGMT та його експресію вивчали за допомогою ПЛР та Вестерн-блот аналізу. Результати. Період становлення ліній клітин миші та ліній клітин людини має загальні тенденції: на першому етапі, який характеризується підвищеною структурною нестабільністю геному, виявлено зростання рівня експресії гена MGMT, а на другому – етапі стабілізації – зниження рівня експресії даного гена. При цьому спостерігали практично повну відсутність немодифікованої форми білка MGMT (24 кДа). Висновки. Встановлено достовірну позитивну кореляцію рівня експресії репаративного ферменту MGMT з мутаційними процесами, які виникають при адаптації клітин до умов культивування у період становлення ліній клітин ссавців.Длительное культивирование клеточных линий неизбежно приводит к возникновению генетических и эпигенетических изменений. Цель Cравнительный анализ кариотипов и уровня экспрессии репаративного фермента MGMT на разных стадиях становления и стабилизации клеточной линии человека 4BL и линии эмбриональных герминативных клеток мыши G1. Методы. Исследовали изменение кариотипа в динамике с использованием дифференциальной окраски хромосом, FISH-метода и сравнительной геномной гибридизации. Ген MGMT и его экспрессию изучали с помощью ПЛР и Вестерн-блот-анализа. Результаты. Период становления клеточных линий человека и мыши характеризуется общими тенденциями: на первом этапе, где наблюдается повышенная структурная нестабильность генома, выявлено возрастание уровня экспрессии гена MGMT, а на втором – этапе стабилизации – снижение уровня экспрессии указанного гена. При этом отмечено практически полное отсутствие немодифицированной формы белка MGMT (24 кДа). Выводы. Обнаружена достоверная позитивная корреляция уровня экспрессии репаративного фермента MGMT с мутационными процессами, возникающими при адаптации клеток к условиям культивирования в период становления клеточных линий млекопитающих

Mesenchymal and trophoblast immunophenotype of multipotent stromal cells from human placenta

The investigation of trophoblast markers expression in the mesenchymal stromal cells of placental tissue before and after their isolation and cultivation. Methods. Placental multipotent mesenchymal stromal cells (MMSC) were obtained by culturing the adhesive fraction of cells enzymatically isolated from the placental tissue. The placental derived cells were immunophenotyped by flow cytometry and immunocytochemistry. Results. It was shown that the placental MMSC express the trophoblast markers: human chorionic gonadotropin, pan-cytokeratin, epidermal growth factor receptor HER2. MMSC-like populations of CD90⁺CD73⁺CD45⁻CD34–⁻CD14⁻-cells and CD90⁻CD73⁺CD45⁻CD34⁻CD14⁻-cells are presented in the placental tissue. Conclusions. The placental MMSC simultaneously express mesenchymal and trophoblast markers.Мета. Дослідити експресію маркерів трофобласта в мультипотентних стромальних клітинах у тканині плаценти та за умов їхнього культивування. Методи. Мультипотентні мезенхімальні стромальні клітини (ММСК) отримували культивуванням адгезивної фракції суспензії клітин тканини плаценти, імунофенотипування клітин проводили за допомогою проточної цитофлуорометрії та імуноцитохімії. Результати. Показано, що ММСК плаценти експресують маркери трофобласта: хоріонічний гонадотропін, цитокератини АЕ1/АЕ3, рецептор епідермального фактора росту HER2. У тканині плаценти присутні подібні за імунофенотипом до ММСК популяції CD90⁺CD73⁺CD45⁻CD34–⁻CD14⁻- клітин і CD90⁺CD73⁺CD45⁻CD34–⁻CD14⁻-клітин. Висновки. Плацентарні ММСК одночасно експресують мезенхімальні та трофобластні маркери.Цель. Исследовать экспрессию маркеров трофобласта в мультипотентных стромальных клетках в ткани плаценты и в условиях их культивирования. Методы. Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК) получали культивированием адгезивной фракции суспензии клеток ткани плаценты, иммунофенотипирование клеток проводили с помощью проточной цито- флуорометрии и иммуноцитохимии. Результаты. Показано, что ММСК плаценты экспрессируют маркеры трофобласта: хорионический гонадотропин, цитокератины АЕ1/АЕ3, рецептор эпидермального фактора роста HER2. В ткани плаценты присутствуют похожие по иммунофенотипу на ММСК популяции CD90⁺CD73⁺CD45⁻CD34–⁻CD14⁻-клеток и CD90⁺CD73⁺CD45⁻CD34–⁻CD14⁻-клеток. Выводы. Плацентарные ММСК одновременно экспрессируют мезенхимальные и трофобластные маркеры