Studies on the Character of Hypothalamic GnRH Neurons and Kisspeptin Neurons Using Hypothalamic Cell Models

The hypothalamic-pituitary-gonadal (HPG) axis controls the hormonal network responsible for reproductive functions. In the past, hypothalamic gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons have been positioned at the highest level in the HPG axis. After the discovery of the indispensable roles of hypothalamic kisspeptin in GnRH neurons, our understanding of the neuroendocrine regulation of the HPG axis was reconfirmed, and it is now recognized that hypothalamic kisspeptin neurons are positioned at the summit of the HPG axis. Accumulating evidence shows that kisspeptin neurons are responsible for the onset of puberty and sex steroid feedback mechanisms by modulating the activity of GnRH neurons. Furthermore, the identification of kisspeptin in the hypophyseal portal circulation suggests that this peptide has some direct roles in the pituitary gland. The detailed mechanisms underlying the regulation of GnRH by kisspeptin and the regulatory control of kisspeptin neurons are still largely unknown because of the limitations of the experimental models. The establishment of GnRH-expressing and kisspeptin-expressing cell models has enabled us to examine the character of these neuronal cells. In this chapter, we describe our in vivo studies examining the character of GnRH neurons and kisspeptin neurons in the hypothalamus using hypothalamic GnRH- and/or kisspeptin-expressing cell models

RNAi技術を駆使したテロメレース制御と婦人科癌の遺伝子治療への応用

金沢大学医薬保健研究域医学系テロメレースはテロメア伸長酵素であり、その活性化は細胞分裂ごとのテロメア短縮を防ぎ、細胞に不死化能を賦与する。テロメレースの活性化はあらゆる癌種に認められる現象であり、癌の分子標的治療のターゲットとなり得る。本研究ではテロメレースを構成する触媒サブユニットであるhTERT (human telomerase reverse transcriptase)をターゲットとして、この遺伝子の発現をRNA interferenceにより抑制し、テロメレース阻害による婦人科癌の遺伝子治療を試みた。我々はHarvard Medical Schoolとの共同によりhTERT遺伝子発現を効率的に抑制するsiRNA配列を見いだし、これらをretrovirusの系で子宮頚癌細胞(HeLaおよびSiHa細胞)に導入してテロメレース活性の変化および細胞増殖に与える影響を詳細に観察した。siRNA導入により子宮頚癌細胞のテロメレース活性およびhTERTmRNA発現は著明に低下した。これらの細胞はPD40-50で老化を起こし、増殖を停止した。軟寒天培地でのコロニー形成およびマウスでの造腫瘍実験では。siRNA導入で著明な発育抑制が認められ、抗腫瘍効果が明らかとなった。以上よりhTERTをターゲットとしたsiRNAテクノロジーで癌の増殖をコントロールできることがわかり、今後の臨床応用に向けてさらに研究を継続させる予定である。研究課題/領域番号:16659447, 研究期間(年度):2004 – 2006出典：「RNAi技術を駆使したテロメレース制御と婦人科癌の遺伝子治療への応用」研究成果報告書　課題番号16659447（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-16659447/)を加工して作

婦人科癌をターゲットにした新たな遺伝子治療の戦略

金沢大学大学院・医学系研究科我々は細胞の不死化過程に関わるとされるテロメレースをターゲットにした遺伝子治療の戦略をたて、これを婦人科癌の遺伝子治療に応用することを試みた。まずテロメレースの構成成分であるhuman telomerase RNA(hTR)をターゲットとしてこれに対するantisense DNAを合成し、その5\u27端に2-5Adenylate(以下2-5A)を付加したキメラ合成DNAによる癌の遺伝子治療の基礎実験を試みた。2-5AはRNAse Lのactivatorであり、antisense sequenceによって会合したtarget RNAをRNAse Lの活性化により分解することが期待される。子宮頚癌細胞であるME180 cellに2-5A anti-hTRをlipofectionにより導入し、hTRの発現を観察したところ、hTRは25-48時間で効率的に分解された。さらにテロメレース活性もそれに引き続いて低下し、細胞増殖も抑制された。細胞増殖抑制の原因としてflow cytometryの解析によりアポトーシスが誘導されていることが判明した。現在アポトーシス誘導機構の解析を行うとともに、動物実験でのin vivoの効果についても検討中である。また我々はテロメレースの酵素活性を担うhuman telomerase reverse transcriptase(hTERT)のプロモーターをクローニングし、これが極めて癌特異性が高いことを報告してきたが、このプロモーターを様々なアポトーシス誘導遺伝子とともにベクターに組み込み、in vitroおよびin vivoでの癌増殖抑制効果を検討した結果、本プロモーターを組み込んだベクターが極めて癌特異性の高い治療用ベクターをなり得ることが確認された。We established novel methods that inhibit telomerase activity in cancer cells using 2-5Adenylate-linked antisense DNA against human telomerase RNA component (hTR). This antisense DNA effectively blocked telomerase activity in cervical cancer ME180 cells. Growth of ME180 cells in vitro was significantly inhibited by the treatment with 2-5A anti-hTR. Surprisingly, inhibition of cell growth was observed in 24-48 hr after treatment, quite earlier than expected. Telomere length was not shortened in this short period. These findings suggest that blockade of telomerase led to cell growth inhibition via telomere-independent mechanisms. We confirmed that growth inhibition of cells by the treatment with 2-5A anti-hTR was due to induction of apoptosis. The further anaylsis of mechanisms how 2-5A anti-hTR induces apoptosis is on going.We also established novel vector system for cancer gene therapy. We previously cloned promoter of human telomerase reverse transcriptase (hTERT), which is highly specific to cancer cells. We thus used this promoter for cancer-specific gene expression in gene delivery system. Various apoptosis-inducible genes, such as caspase-8 and FADD, were combined with hTERT promoter and used as vectors for cancer gene therapy. Introduction of these vectors effectively induced apoptosis of cancer cells but of surrounding normal tissues.研究課題/領域番号:13557138, 研究期間(年度):2001 – 2002出典：「婦人科癌をターゲットにした新たな遺伝子治療の戦略」研究成果報告書　課題番号13557138（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/report/KAKENHI-PROJECT-13557138/135571382002kenkyu_seika_hokoku_gaiyo/)を加工して作

テロメレース特異的癌融解ウイルスによる婦人科腫瘍の遺伝子治療の開発

金沢大学医薬保健研究域医学系我々は従来から遺伝子治療のベクターとして用いられてきたウイルスの毒性に着目し、ウイルス自らが生体内で増殖複製し、その感染毒性により細胞を死滅させるシステムを模索してきた。また我々はテロメレース触媒サブユニットであるhTERT(Human telomerase reverse transcriptase)遺伝子プロモーターを世界で初めてクローニングし、このプロモーターが癌細胞特異的に活性化されることを報告してきた。本研究ではhTERTプロモーターをアデノウイルスtype5の複製に必要な自己蛋白E1Aの遺伝子の上流に組み込んだ増殖型ウイルス(TRAD: telomerase-specific replication-competent adenovirus)を開発し、in vitroおよびin vivoで腫瘍特異的増殖を確認するとともに、その抗腫瘍効果を明らかにした。TRADの腫瘍への直接注入により明確な造腫瘍抑制効果が認められる一方で、他臓器への毒性は認められなかった。一方でTRADは注入部位より拡散し、血流に乗って遠隔病巣にも到達し得ることが明らかとなった。このことは転移病巣にも有効である可能性を示唆する。またTRADは抗癌剤耐性細胞にも有効であり、さらには既存の抗癌剤との併用で相乗作用を有することも報告してきた。現在このウイルスはOncolys社との共同開発により米国で臨床試験を行っている。We previously cloned the promoter of human reverse transcriptase (hTERT) gene, a catalytic subunit of human telomerase, which was found to be active only in cancer cells with telomerase activity, while it was silent in most normal cells without telomerase activity. We have planned to insert this promoter into the upstream of the El gene of Adenovirus type 5 genome so that adenovirus El gene is efficiently expressed only in cancer cells. Eventually, this chimera virus can replicate only in cancer cells with high levels of expression of El gene, which is required for viral replication. We named this virus TRAD: telomerase-specific replication adenovirus. In the present project, we examined the in vitro and in vivo efficacy of TARD directly injected into primary site of tumors. We found that TARD was effective to reduce tumor burden without exhibiting any severe adverse effect, such as myelosurpression or liver dysfunction caused by viral toxicity Therefore, we propose the clinical use of this virus.研究課題/領域番号:17390449, 研究期間(年度):2005 – 2007出典：研究課題「テロメレース特異的癌融解ウイルスによる婦人科腫瘍の遺伝子治療の開発」課題番号17390449（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/ja/report/KAKENHI-PROJECT-17390449/173904492007kenkyu_seika_hokoku_gaiyo/）を加工して作

腫瘍特異的増殖ウイルスを用いた婦人科癌細胞の生体内イメージングシステムの構築

金沢大学医学系我々は癌細胞に特異的に発現し不死化能を付与する酵素テロメレース(human telomerase reverse transcriptase(hTERT))のプロモーターをクローニングすることに成功した。このプロモーターはこれまで報告されてきたどのプロモーターよりも癌細胞特異性が高くかつ、強力であった。アデノウイルスの複製には自らのE1A,E1B遺伝子の発現を必要とするが、これらの遺伝子の上流にhTERTプロモーターを組み込むと、E1A,E1B遺伝子がテロメレース陽性の癌細胞でのみ発現し、癌細胞選択的にウイルスが複製する。このウイルスはTelomerase-specific Replication Adenovirus(TRAD)と呼ばれる。TRADの腫瘍特異性は治療や診断にも大いに利用できる可能性がある。我々はTRADにGFP遺伝子を組み込んだTRAD-GFPを開発した。このウイルスは癌細胞で複製した結果、GFP遺伝子が過剰発現することにより蛍光を発する。今回我々はマウスモデルを用いてTRAD-GFPを腫瘍に注入し、原発巣のみならず転移リンパ節、特にセンチネルリンパ節の癌細胞をvisualizeすること、さらには他の転移巣、播種病巣の蛍光の検出により術中の転移癌細胞の検出が可能であることを明らかにした。研究課題/領域番号:19659420, 研究期間(年度):2007 – 2009出典：研究課題「腫瘍特異的増殖ウイルスを用いた婦人科癌細胞の生体内イメージングシステムの構築」課題番号19659420（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-19659420/）を加工して作

テロメレース活性化の分子機構の解明

金沢大学医薬保健研究域医学系我々は1999年にhTERTプロモーターのクローニングに成功して以来、hTERT発現の分子機構を解析してきた。hTERT転写活性化因子としてc-Myc/MaxやSp1,ER, EWSなどいくつかの因子を見いだしたがこれらの因子では癌特異的なテロメレース活性化機構を説明するのは不十分であり、他に重要な機構が存在すると推定される。そのひとつが正常細胞におけるhTERT抑制機構である。今回の研究ではERM (Enhanced Retroviral Mutagenesis) systemを用いてhTERT転写抑制因子のクローニングを試みた。HeLa細胞を用いてtTA細胞を樹立し、hTERT promoter-GFPレポーター遺伝子を導入した。TREおよびsplicing donar sequenceを含むプロモーター領域をLTR下流につないだレトロウイルスベクターを上記tTA細胞に導入し、GFP発光強度が著しく減少した細胞集団をFACS解析にて回収した。さらに2次スクリーニングでテトラサイクリンを添加し、GFP陽性転化する2クローンを回収した。現在これらのクローンでレトロウイルス下流に存在する遺伝子の単離を進めている。さらにhTERT転写活性化に関わる新たな転写因子として低酸素環境下に誘導されるHIF1がhTERT core promoterのE-boxに直接結合し、低酸素化で腫瘍細胞のhTERT転写活性化に重要な役割を演じていることを明らかにした。研究課題/領域番号:16021215, 研究期間(年度):2004出典：「テロメレース活性化の分子機構の解明」研究成果報告書　課題番号16021215（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-16021215/)を加工して作

子宮頚癌の細胞分化にともなうヒトパピローマウイルス癌遺伝子発現機構の解明

金沢大学医学部附属病院ヒト重層扁平上皮細胞に感染したヒトパピローマウイルス(HPV)の遺伝子発現を制御する細胞因子を同定するために、まずHPV type31 を用いてtransient expression assayによるHPV promter-enhancerの同定を試みた。その結果HPV long control regionの中央部約260bPのenhancer領域を同定した。続いてこのenhancerに結合する核内蛋白をDNA-protein binding assay(Footprint analysis,Gel shift assay)により解析したところ、癌遺伝子産物APl、未同定の蛋白F1,F2,F5および転写因子Oct-1が結合することが判明した。mutation assayにより、この中でHPVpromoterの転写にcriticalな因子を検討したところ、AP1が最も重要な転写調節因子であることが判明した。続いてraft cutureによりHPV31 genomeをepisome状態で含有する細胞を重層培養し、AP1の局在を免疫組織染色で確認したところ、重層扁平上皮の基底および傍基底細胞層に発現を認めた。in situ hybridization法でHPVの癌遺伝子産物であるE6,E7のmRNAの発現を確認したところ、APlの局在とほぼ一致した基底層、傍基底層に発現を認めた。以上のことからHPVの遺伝子発現には細胞性因子AP1の発現が重要なdeterminantであることが明らかになった。AP1の発現はHPVの細胞種特異性を決定する因子のひとつであると考えられる。さらに我々はlong control regionのより上流に新たなenhancerを同定し、この領域に結合しAP1との共同作用でHPV遺伝し発現を活性化する因子YY1を特定した。以上よりAP1とYY1二つの核内蛋白をtargetにした子宮頚癌の遺伝子治療の可能性が示唆された。To clarify the molecular mechanisms through which human papillomavirus E6/E7 expression is activated during the process of cellular differentiation in stratified epithelial cells of uterine cervix, we identified core enhancer of upstream regulatory region of HPV3 1 b E6/E7 genes using transient expression assays. DNA foot print analyses and gel shift analyses identified sevral nuclear factors which bind core enhancer and regulate transcription of E6/E7 genes. In particular, Ap1 was found to be the most potent transactivator. In situ hybridization analyses revealed that E6/E7 mRNA was expressed mainly in the undifferentiated basal layers of stratified epithelial cells in uterine cervix, which was co-localized with AP1 expression determined by immunohistochemical analyses. These findings suggest that AP1 is the critical determinant of HPV oncogene expression. In addition, we found that cellular factor YY1 cooperates with API to achieve full activation of HPV oncogene expression. These results may provide insight into molecular targets for gene therapies against cervical cancer induced by HPV infection.研究課題/領域番号:08671876, 研究期間(年度):1996 – 1998出典：研究課題「子宮頚癌の細胞分化にともなうヒトパピローマウイルス癌遺伝子発現機構の解明」課題番号08671876（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/ja/report/KAKENHI-PROJECT-08671876/086718761998kenkyu_seika_hokoku_gaiyo/）を加工して作

Phase I Clinical Study of the Dietary Supplement, Agaricus blazei Murill, in Cancer Patients in Remission

Although many cancer patients use complementary and alternative medicine, including Agaricus blazei Murill (ABM), safety is not yet well understood. Cancer survivors took 1.8, 3.6, or 5.4 g ABM granulated powder (Kyowa Wellness Co., Ltd., Tokyo, Japan) per day orally for 6 months. Adverse events were defined by subjective/objective symptoms and laboratory data according to the National Cancer Institute Common Terminology Criteria for Adverse Events version 3.0 (NCI-CTCAE v3.0). Seventy-eight patients were assessed for safety of ABM (30/24/24 subjects at 1/2/3 packs per day, resp.). Adverse events were observed in 9 patients (12%). Most were digestive in nature such as nausea and diarrhea, and one patient developed a liver dysfunction-related food allergy, drug lymphocyte product. However, none of these adverse events occurred in a dose-dependent manner. This study shows that ABM does not cause problems in most patients within laboratory parameters at the dosages tested over 6 months. This trial supports previous evidence that the ABM product is generally safe, excluding possible allergic reaction

Understanding and exploiting hTERT promoter regulation for diagnosis and treatment of human cancers

がん進展制御研究所　Telomerase activation is a critical step for human carcinogenesis through the maintenance of telomeres, but the activation mechanism during carcinogenesis remains unclear. Transcriptional regulation of the human telomerase reverse transcriptase (hTERT) gene is the major mechanism for cancer-specific activation of telomerase, and a number of factors have been identified to directly or indirectly regulate the hTERT promoter, including cellular transcriptional activators (c-Myc, Sp1, HIF-1, AP2, ER, Ets, etc.) as well as the repressors, most of which comprise tumor suppressor gene products, such as p53, WT1, and Menin. Nevertheless, none of them can clearly account for the cancer specificity of hTERT expression. The chromatin structure via the DNA methylation or modulation of nucleosome histones has recently been suggested to be important for regulation of the hTERT promoter. DNA unmethylation or histone methylation around the transcription start site of the hTERT promoter triggers the recruitment of histone acetyltransferase (HAT) activity, allowing hTERT transcription. These facts prompted us to apply these regulatory mechanisms to cancer diagnostics and therapeutics. Telomerase-specific replicative adenovirus (Telomelysin, OBP-301), in which E1A and E1B genes are driven by the hTERT promoter, has been developed as an oncolytic virus that replicates specifically in cancer cells and causes cell death via viral toxicity. Direct administration of Telomelysin was proved to effectively eradicate solid tumors in vivo, without apparent adverse effects. Clinical trials using Telomelysin for cancer patients with progressive stages are currently ongoing. Furthermore, we incorporated green fluorescent protein gene (GFP) into Telomelysin (TelomeScan, OBP-401). Administration of TelomeScan into the primary tumor enabled the visualization of cancer cells under the cooled charged-coupled device (CCD) camera, not only in primary tumors but also the metastatic foci. This technology can be applied to intraoperative imaging of metastatic lymphnodes. Thus, we found novel tools for cancer diagnostics and therapeutics by utilizing the hTERT promoter. © 2008 Japanese Cancer Association

PPP2R1A (protein phosphatase 2 regulatory subunit A, alpha)

Review on PPP2R1A, with data on DNA, on the protein encoded, and where the gene is implicated