Staphylococcus aureus as a pathogen and antimicrobial screening with a co-culture of host cells and a pathogen

Staphylococcus aureus is a common commensal and significant opportunistic pathogen. It causes a wide range of infections from superficial skin infections to serious invasive infections. Its pathogenicity is affected by many factors, such as different surface proteins as well as the excretion of toxins and extracellular enzymes. It has many ways to defend a host defense system, such as the formation of capsule and small-colony variants as well as intracellular hiding. Treatment of infections is hindered due to its ability to form resistance to almost every antimicrobial agent used. So far the development of a working and effective vaccine has not been successful. The discovery of new antibacterial agents seems to be still the only efficient way to fight against resistant bacterial strains. However, the development of new antibacterial agents has proved to be difficult. Developing new screening methods is important in order for new drugs to reach the market more effectively and to ensure that new derivatives are more effective and safer. The experimental part of this study aimed at establishing a co-culture of host cells and a pathogen, and to investigate active compounds from primary screen with the established method (Kleymann and Werling 2004). Host cells in the co-culture was HL (Human Lung) cell line and the pathogen was S. aureus (ATCC 25923). Experimental work began by determining bacterial colony-forming units (CFU) and its correlation with absorbance. Based on CFU-determinations the bacterial concentration in the culture media was calculated. Next, the method was optimized and validated. In optimization, statistical parameters S/B-, S/N-values, and Z'-factor were used. Method was optimized regarding cell and bacterial concentrations and incubation time. The method was validated using known antimicrobials. Screening of compounds to be studied was carried out in two stages. All the compounds were first screened in a primary screen. The primary screening method was a standard antibacterial measurement based on turbidometry. Those compounds that were active in the primary screen were investigated in a secondary screen with a co-culture method, but none of the studied compounds showed antimicrobial activity against S. aureus. Therefore we studied the impact of medium that was used in the co-culture method to the activity of the compounds. It was found that the medium had a significant effect on the antibacterial activity of the compounds, the activity was weakened in the presence of the medium. In conclusion, w the established co-culture method is a powerful way to obtain simultaneously information on antibacterial activity as well as cytotoxicity, and it is well suited for further testing of promising compounds.Staphylococcus aureus on yleinen kommensaali ja merkittävä opportunistinen patogeeni. Sen aiheuttamien infektioiden kirjo on laaja pinnallisista ihoinfektioista aina vakaviin invasiivisiin infektioihin. S. aureuksen taudinaiheuttamiskykyyn vaikuttavat monet tekijät, kuten erilaiset pintaproteiinit sekä sen erittämät toksiinit ja solunulkoiset entsyymit. Sillä on monia keinoja puolustautua isäntäorganismin puolustusjärjestelmältä, kuten kapselin ja pienipesäkkeisten muunnosten muodostaminen sekä solunsisäinen piileskely. S. aureuksen aiheuttamien infektioiden hoitoa vaikeuttaa sen kyky muodostaa resistenssiä lähes kaikille käytössä oleville antimikrobiaineille. Toistaiseksi sitä vastaan ei ole onnistuttu kehittämään toimivaa ja tehokasta rokotetta. Uusien bakteerilääkkeiden kehittäminen on ainoa keino taistella resistenttejä bakteerikantoja vastaan. Tämä on kuitenkin osoittautunut vaikeaksi. Seulontamenetelmien kehittäminen on tärkeää, jotta uusia lääkkeitä saataisiin markkinoille entistä tehokkaammin ja jotta uudet johdokset olisivat entistä tehokkaampia ja turvallisempia. Kokeellisen työn tarkoituksena oli perustaa patogeenin ja isäntäsolun yhteisviljelmämenetelmä sekä tutkia primaariseulonnassa aktiiviseksi osoittautuneiden yhdisteiden antimikrobista aktiivisuutta perustetulla menetelmällä (Kleymann ja Werling 2004). Isäntäsoluna yhteisviljelmässä oli HL (Human Lung)-solulinja ja patogeeninä S. aureus (ATCC 25923). Kokeellinen työ aloitettiin bakteerin pesäkkeitä muodostavien yksiköiden (PMY) määrän ja absorbanssin välisen korrelaation selvittämisellä. PMY-määritysten perusteella saatiin standardisuoran yhtälö, jonka avulla laskettiin bakteerikonsentraatio kasvatusliuoksessa absorbanssin perusteella. Seuraavaksi suoritettiin yhteisviljelmämenetelmän optimointi ja validointi. Optimoinnin apuna käytettiin tilastollisia parametrejä S/B-, S/N-arvoja ja Z'-tekijää. Menetelmässä optimoitiin kuoppalevylle istutettavien solujen määrä, infektoinnissa käytettävä bakteerimäärä ja inkubointiaika. Menetelmä validoitiin tunnettujen antimikrobiaineiden avulla. Tutkittavien yhdisteiden seulonta suoritettiin kaksivaiheisesti. Ensin kaikille tutkittaville yhdisteille tehtiin perusantibakteerimääritys turbidimetrisellä menetelmällä. Primaariseulonnassa aktiiviseksi osoittautuneet yhdisteet jatkotestattiin annosvastemäärityksenä yhteisviljelmämenetelmällä, mutta millään tutkituista yhdisteistä ei havaittu antimikrobista aktiivisuutta S. aureusta vastaan. Tämän vuoksi haluttiin testata vielä yhteisviljelmämenetelmässä käytetyn RNmediumin vaikutus tutkittavien yhdisteiden aktiivisuuteen ja havaittiin, että käytetty medium. heikensi aktiivisuutta merkittävästi. Yhteisviljelmämenetelmällä saadaan paljon informaatiota tutkittavan yhdisteen antimikrobi- ja sytoksisuusominaisuuksista ja se soveltuu hyvin lupaavien yhdisteiden jatkotestaukseen

(+)-Dehydroabietic Acid, an Abietane-Type Diterpene, Inhibits Staphylococcus aureus Biofilms in Vitro

Peer reviewe