Etude d'une nouvelle voie d'activation de la protéine kinase Akt, rôle de la PhosphoInositide 3-kinase

La régulation des mécanismes de survie cellulaire fait intervenir de nombreuses molécules parmi lesquelles la protéine kinase Akt qui joue un rôle important. Les travaux du laboratoire ont permis de montrer qu'il existe une voie alternatvie de régulation de Akt et l'objectif de ce travail a été la caractérisation de cette voie. Dans cette voie de signalisation la GTPase Rac active la protéine Akt par le biais de l'activité de la phosphoInositide 3-kinase (PI3K).Nous avons pu montrer que l'une des particuliratés de cette voie de signalisation se manifeste par le fait que l'activation d'Akt par Rac est dépendante de l'adhérence ; en effet, cette activation ne peut se faire que lorsque les cellules sont non adhérentes. Une seconde particularité de cette voie est que Rac agit en amont de la PI3K. Nous nous sommes alors intéressés à la régulation de la PI3K au sein de cette voie et nous avons exploré la possibilité que la GTPase Rac puisse moduler l'activité de la PI3KBORDEAUX1-BU Sciences-Talence (335222101) / SudocSudocFranceF

Spécificités de l endothélium aortique dans un modèle de souris Marfan

La formation de podosomes dans les cellules endothéliales (Ces) aortiques en réponse au TGFb est bien décrite in vitro (dans des boîtes de culture) et ex vivo (dans des segments de vaisseaux aortiques vivants). Le projet de cette thèse était de franchir l étape suivante en démontrant la présence de podosomes in vivo en réponse à du TGFb d origine endogène. Pour ce faire, nous avons choisi d utiliser un modèle de souris génétiquement modifiées présentant spontanément des niveaux de TGFb élevés dans la paroi aortique, raisonnant que cet environnement devrait être propice à l apparition des structures. La souris Marfan (FbnC1039G/+) constitue le modèle murin de la maladie humaine appelée syndrome de Marfan . Chez la souris comme chez l homme, une mutation dans le gène codant pour la fibrilline-1 conduit à une augmentation des niveaux de TGFb dans la paroi aortique et dans le sang circulant. Nous avons utilisé ce modèle pour rechercher la présence de podosomes dans l'endothélium aortique. La visualisation en face de l'endothélium marqué pour l actine fibrillaire, la cortactine, la protéine adaptatrice Tks5 et la metalloprotéase MT1-MMP, a révélé des rosettes de podosomes semblables à celles détectées ex vivo en réponse à du TGFb d origine exogène. Ces rosettes peuvent être trouvées dans l'endothélium de l'aorte ascendante ou descendante. L analyse du tissu sous-jacent révèle une détérioration de la lame basale qui apparait parsemée de zones dépourvues d un de ses constituants majeurs, le collagène IV. Nous émettons l'hypothèse que les rosettes de podosomes sont impliquées dans la formation de ces zones de dégradation du collagène IV. Pour examiner les conséquences du déficit en fibrilline-1 pour les CEs et confirmer les données in vivo concernant la souris Marfan, nous avons utilisé deux approches in vitro. D abord, nous avons mis au point un protocole pour isoler les CEs aortiques à partir des souris Marfan. Ensuite, nous avons, par la stratégie des siRNA, procédé à la déplétion en fibrilline-1 de CEs aortiques d origine bovine (BAEc). Les cellules endothéliales aortiques isolées des souris Marfan conservent in vitro le phénotype TGFb et forment podosomes capables de dégrader la matrice extracellulaire sans aucune stimulation exogène. Dans le modèle des cellules BAE, le dosage du TGFb indique que, in vitro, la déplétion de ces cellules en fibrilline-1 provoque une augmentation de TGFb biologiquement actif associé à la fraction cellulaire. Ce TGFb conduit alors à la formation de podosomes dans les CEs. Nous avons observé d autres conséquences du déficit en fibriline-1 dans l endothélium in situ. L analyse topologique de la surface de l endothélium aortique de la souris Marfan révèle des phénomènes de blebbing , des filopodes, des anomalies des jonctions cellules-cellules. L analyse ultrastructurale en microscopie électronique à transmission révèle que l endothélium de la souris Marfan a une apparence radicalement distincte de celui observé chez les témoins sauvages. La lame élastique, fragilisée par le déficit en fibrilline-1, disparaît comme digérée, par endroits. On observe une sécrétion anormale de matrice extracellulaire. Les cellules présentent un phénotype activé ou des signes d apoptose. Ces études fournissent la première démonstration de l'apparition de podosomes endothéliaux in vivo et suggèrent leur implication en physiopathologie vasculaire. Elles fournissent également la première démonstration que l endothelium aortique est profondément modifié dans le modèle murin de la maladie de Marfan.Podosome formation in aortic endothelial cells exposed to TGFb has been well described in vitro (in tissue culture dishes) and ex vivo (in living aortic vessel segments). The aim of the project was to go to the next step and demonstrate the occurrence of podosomes in vivo in response to endogenous TGFb. For this purpose, we chose to use a genetically engineered mouse model, which spontaneously presents high TGFb levels in the aorta, reasoning that this would be a favorable environment for these structures to appear. Marfan mice represent the murine model of the human disease Marfan syndrome. Similar to the human disease, a mutation in the fibrillin-1 gene (C1039G/+) leads to enhanced TGFb levels in the aortic wall as well as in circulating blood. We therefore used the Marfan mouse model in search of podosomes in the aortic endothelium. En face viewing of the endothelium stained for filamentous actin, cortactin, Tks5 adaptator protein and MT1-MMP metalloprotease detected podosome rosettes with features similar to those detected in the ex vivo situation. Podosome rosettes were found in both descending and ascending aorta. Analysis of the underlying tissue with collagen IV staining revealed a basement membrane scattered with staining-free patches, most likely corresponding to collagen IV degradation. We propose that podosome rosettes are involved in basement membrane degradation in this mouse. To examine the consequences of fibrillin-1 deficiency in endothelial cells and confirm the data obtained in vivo in Marfan mouse aorta, we used two in vitro approaches. First, we set up a protocol to isolate aortic endothelial cells from Marfan aortas, second, we depleted fibrillin-1 from BAE cells by siRNA silencing. Isolated Marfan aortic endothelial cells retained in vitro the TGFb activated phenotype and formed functional podosomes without any exogenous stimulation. TGFb levels measurements in fibrillin-1 depleted aortic endothelial cells confirmed that fibrillin-1 deficiency triggers an increase in active, cell associated TGFb, which in turns, leads to podosome formation in endothelial cells. Finally we studied other alterations caused by the fibrillin-1 defect at the endothelial cell level in situ. Topological analysis of the Marfan mouse aortic endothelium monolayer revealed cell blebbing, numerous filopodia and showed altered cell-cell junctions. At the ultrastructural level, transmission electronic microscopy revealed that the Marfan mouse endothelium had an appearance dramatically distinct from that observed in control littermates. The elastic lamina, weakened by fibrillin-1 deficit, disappeared in some places. The vessel wall also showed abundant extracellular matrix proteins. Endothelial cells presented an activated or apoptotic phenotype. These studies provide the first demonstration for the occurrence of endothelial podosomes in vivo and suggest their involvement in vascular physiopathology. In addition, they provide evidence that the aortic endothelium is profoundly altered in the murine model of Marfan syndrome.BORDEAUX2-Bib. électronique (335229905) / SudocBORDEAUX1-Bib.electronique (335229901) / SudocSudocFranceF

Science-writing in the blogosphere as a tool to promote autonomous motivation in education

We sought to establish a collaborative learning environment for our first-year university cell biology course that would be sufficiently challenging to warrant team effort and turn students into autonomous learners. We chose team-based science-writing blogs, a choice grounded in the Self Determination Theory. This theory posits that a sense of autonomy, competence and relatedness are essential requirements to perform a task in an autonomous-motivated fashion. Through surveys over a period of four years, we assessed how students perceived the blog project. Qualitative analyses revealed that students recognized and appreciated their autonomy. They also consistently considered as positive a sense of competence, expressed as being useful, and relatedness, i.e. relating with others and working together. A quantitative analysis based on an intrinsic-motivation inventory revealed that students experienced science-writing on the web as an intrinsically motivating learning task. We conclude that web-based learning triggers motivation to learn autonomously and discuss how task authenticity may play an important role in this process

Rôles du TGFb1 dans la régulation de la différenciation myélo-monocytaire

L'objectif principal de ce travail est la mise en évidence du rôle du TGFb1 dans la différenciation myélo-monocytaire.b Nous avons montré que le TGFb1 agit sur l'activation de Rap1 et de l'intégrine amb2 chez une lignée pro-monocytaire humaine et chez les monocytes : le TGFb1 réduit considérablement l'activation de Rap1 et des intégrines b2, ainsi que la migration transendothéliale. Dans le contexte de la pathologie athéroscléreuse, le TGFb1 possèderait ainsi la caractéristique de réduire les premie res étapes du processus inflammatoire à savoir le recrutement des monocytes, l'adhérence à l'endothélium et la migration transendothéliales, et pourrait ainsi exercer un rôle protecteur dans la pathologie de l'athérosclérose. Nous avons également montré que le TGFb1 en synergie avec CD44 était impliqué dans le processus de différenciation myélo-monocytaire. Ainsi en présence deCD44, le TGFb1 induit l'expression de p47phox, un composant de la NAPH oxydase fonctionnelle.BORDEAUX1-BU Sciences-Talence (335222101) / SudocSudocFranceF

Les techniques de traitement numérique des images en appui à l’amélioration du rapport épistémologique des élèves au vivant

Amener les élèves à interagir avec les images scientifiques pour qu’ils prennent conscience du caractère construit de toute représentation sémiotique du vivant est le but de cette étude. Avec l’arrivée du tout numérique qui a suppléé avantageusement l’image papier dans la représentation iconographique du vivant, de nouvelles façons de faire façonnent les pratiques scolaires. Le cycle du secondaire a intégré depuis près de deux décades l’utilisation d’images virtuelles de type infographique qui représentent des caractéristiques du vivant mais reconstituées ou créées de toute pièce. Malgré leur fort degré de suggestion, ces images offrent aux élèves des possibilités d’interactions limitées. A contrario, traiter numériquement des images « réelles » du vivant (telles que les microphotographies cellulaires) à l’aide de logiciels spécialisés, permet à l’élève de s’exercer aux procédures techniques d’amélioration du rendu de ces images et lui permet ainsi de mieux saisir la fonction des images scientifiques qui n’est pas celle de « montrer » mais celle d’outiller la réflexion. L’autre enjeu dépasse le cadre strict de la compréhension de l’imagerie biologique, c’est celui d’inculquer aux élèves une culture visuelle préalable à l’émergence d’une forme de vigilance épistémologique face à la représentation de toute chose

Les techniques de traitement numérique des images en appui à l’amélioration du rapport épistémologique des élèves au vivant

Amener les élèves à interagir avec les images scientifiques pour qu’ils prennent conscience du caractère construit de toute représentation sémiotique du vivant est le but de cette étude. Avec l’arrivée du tout numérique qui a suppléé avantageusement l’image papier dans la représentation iconographique du vivant, de nouvelles façons de faire façonnent les pratiques scolaires. Le cycle du secondaire a intégré depuis près de deux décades l’utilisation d’images virtuelles de type infographique qui représentent des caractéristiques du vivant mais reconstituées ou créées de toute pièce. Malgré leur fort degré de suggestion, ces images offrent aux élèves des possibilités d’interactions limitées. A contrario, traiter numériquement des images « réelles » du vivant (telles que les microphotographies cellulaires) à l’aide de logiciels spécialisés, permet à l’élève de s’exercer aux procédures techniques d’amélioration du rendu de ces images et lui permet ainsi de mieux saisir la fonction des images scientifiques qui n’est pas celle de « montrer » mais celle d’outiller la réflexion. L’autre enjeu dépasse le cadre strict de la compréhension de l’imagerie biologique, c’est celui d’inculquer aux élèves une culture visuelle préalable à l’émergence d’une forme de vigilance épistémologique face à la représentation de toute chose

The T-Cell Receptor Regulates Akt (Protein Kinase B) via a Pathway Involving Rac1 and Phosphatidylinositide 3-Kinase

The serine/threonine kinase Akt (also known as protein kinase B) (Akt/PKB) is activated upon T-cell antigen receptor (TCR) engagement or upon expression of an active form of phosphatidylinositide (PI) 3-kinase in T lymphocytes. Here we report that the small GTPase Rac1 is implicated in this pathway, connecting the receptor with the lipid kinase. We show that in Jurkat cells, activated forms of Rac1 or Cdc42, but not Rho, stimulate an increase in Akt/PKB activity. TCR-induced Akt/PKB activation is inhibited either by PI 3-kinase inhibitors (LY294002 and wortmannin) or by overexpression of a dominant negative mutant of Rac1 but not Cdc42. Accordingly, triggering of the TCR rapidly stimulates a transient increase in GTP-Rac content in these cells. Similar to TCR stimulation, L61Rac-induced Akt/PKB kinase activity is also LY294002 and wortmannin sensitive. However, induction of Akt/PKB activity by constitutive active PI 3-kinase is unaffected when dominant negative Rac1 is coexpressed, placing Rac1 upstream of PI 3-kinase in the signaling pathway. When analyzing the signaling hierarchy in the pathway leading to cytoskeleton rearrangements, we found that Rac1 acts downstream of PI 3-kinase, a finding that is in accordance with numerous studies in fibroblasts. Our results reveal a previously unrecognized role of the GTPase Rac1, acting upstream of PI 3-kinase in linking the TCR to Akt/PKB. This is the first report of a membrane receptor employing Rac1 as a downstream transducer for Akt/PKB activation