До методики отримання стовбурових клітин міокарда котів

Year 2003 may be considered as the beginning of the study of “stem cells of the adult heart”, when Beltrami A.P. with his colleagues finally confirmed the presence of the latter in the heart. Later, Makkar R.R. and others proved the efficacy of these cells for treatment of myocardial ischemia. However, despite the positive effect of the use of “stem cells of the adult heart” for myocardial ischemia, an obstacle to their global clinical use are the ethical issues and difficulty in obtaining. Given the above, the aim of our work was to determine the optimal method of obtaining stem cells from the myocardium of cat. The experiments on animals were performed in accordance with the requirements of the “General ethical principles for Experiments on Animals” adopted by the first National Congress on bioethics (dated 20.09.04, Kyiv, Ukraine). To obtain heart tissues the frozen fetuses of kittens, that remained after providing the birth assistance, were used (with the consent of the owners). In order to determine the optimal method for obtaining a stem cells culture of the myocardium of cat we compared the explant method and enzymatic treatment methods of tissues using different combinations of enzymes: 2 mg/ml of collagenase (type II); 2 mg/ml of collagenase (type II) supplemented with 5% bovine serum; 1 mg/ml of collagenase (type II), 1 mg/ml of hyaluronidase and 5% BSA; 2.5% of trypsin; 2.5% of trypsin, 0.5 mg/ml of collagenase (type II) and 0.5 mg/ml of hyaluronidase. In order to determine the optimal method for obtaining a cells culture of the myocardium the counting of the number of cells after the formation of monolayer in one of the experimental groups was carried out (day 5 since the beginning of the  research). The counting of number of cells was performed in the Gorjaev's chamber under 200 magnification of microscope in all the squares. The most effective method for obtaining the stem cells culture from the myocardium is to use a combination of enzymes 2.5% of trypsin, 0.5 mg/ml of collagenase (type II) and 0.5 mg/ml of hyaluronidase, which allows to obtain 986.0 ± 9.3 thousand cells capable for proliferation with 10 mg of tissue. The least effective was the explant method (without use of enzymes), because the number of cells attached to the cultural plastic of the cells during its use on day 5 of cultivation was amounted 35.7 ± 6.2 thousand. The proposed method is optimal for obtaining the stem cells culture of the myocardium of the cat, which will be used later in our studies in the treatment of diseases of the heart muscle.Початком дослідження стовбурових клітин серця можна вважати 2003 рік, коли Beltrami A.P. з колегами підтвердили наявність останніх у міокарді. Пізніше Makkar R.R. та ін. довели ефективність даних клітин за лікування ішемії  міокарда. Проте, незважаючи на позитивний ефект від застосування міокардіальних стовбурових клітин за ішемії міокарда, перешкодою для  їх масового клінічного застосування є етичні суперечності та складність в отриманні. Зважаючи на вищесказане, метою нашої роботи було визначення оптимального методу отримання стовбурових клітин з міокарду кота. Експерименти на тваринах були виконані відповідно до вимог “Загальних етичних принципів експериментів на тваринах”, схвалених I Національним конгресом з біоетики (20.09.04 р., Київ, Україна). Для отримання тканин серця використовували завмерлі плоди кошенят (за згоди господарів), що залишалися після надання рододопомоги. Для визначення оптимального методу отримання культури стовбурових клітин міокарда кота нами було порівняно метод експланту та методи ферментативної обробки тканин з використанням різних комбінацій ферментів: 2 мг/мл колагенази (тип ІІ); 2 мг/мл  колагенази (тип ІІ) з додаванням 5% бичачого сироваткового альбуміну (BSA); 1 мг/мл колагенази (тип ІІ),1 мг/мл гіауронідази та 5% BSA; 2,5% трипсину; 2,5% трипсину, 0,5 мг/мл колагенази (тип ІІ) та 0,5 мг/мл гіалуронідази. Найбільш оптимальним методом отримання культури стовбурових клітин міокарда вважали метод, за якого найшвидше утворювався моношар клітин у одній із чашок Петрі. При цьому враховували кількість клітин у моношарі, які підраховували у камері Горяєва за допомогою мікроскопу при збільшенні у 200 разів. Найбільш ефективним методом отримання культури стовбурових клітин міокарда котів є використання комбінації ферментів: 2,5% трипсину, 0,5 мг/мл колагенази (тип ІІ) та 0,5 мг/мл гіалуронідази, що дозволяє з 10 мг тканин серця отримати 986,0 ± 9,3 тис. клітин, здатних до проліферації. Найменш ефективним виявився метод експланту (без використання ферментів), оскільки кількість прикріплених до культурального пластику клітин за його використання на 5 добу культивування складала 35,7 ± 6,2 тис

INFLUENCE OF MEDIUM ON SAFETY OF STEM CELLS DURING CRYOPRESERVATION

У даній статті представленні результати дослідження впливу кріоконсервування мезенхімальних стовбурових клітин різного складу кріосередовищ. Порівняно  захисні властивості п’яти середовищ. Вплив кріосередовищ оцінювали на підставі визначення  життєздатності та збереження адгезивних властивостей клітин після розмороження. Дослідження проведенні на клітинах собаки, кота та кроля.В данной статье представлены результаты исследования влияния криоконсервирование мезенхимальных стволовых клеток состава криозащитных сред. Представлены результаты защитных свойства пяти сред. Действие криосред оценивали на основании определения жизнеспособности и сохранения адгезивных свойств клеток после размораживания. Исследование проведены на клетках собаки, кота и кролика.This article presenting results of investigations on depending on the composition of cryoprotective media of cryopreservation of mesenchymal stem cells. Compared protective properties of the five cryopreservation medium. Action cryopreservation medium evaluated on the basis of the definition of sustainability and conservation adhesive properties of cells after thawing. Research on cells carrying a dog, cat and rabbit

Мікроскопічні зміни в печінці, серці і нирках щурів за алоксанового цукрового діабету

To make future researches of the results of treatment of diabetes possible, it is necessary to create a model of this pathology in experimental animals. It is crucial to trace the correlation between changes in organs when this pathology occurs in clinical cases and when it occurs in experimental cases. Today we have a number of methods used to form alloxan diabetes in animals, but alloxan monohydrate is the most frequently used. Thus, the purpose of our study was to: study microscopic changes in the liver, heart, and kidneys of alloxan diabetes rats. The experimental model of diabetes was reproduced by a 150 mg/kg single-dose subcutaneous administration of alloxan monohydrate in the form of a 5% solution per citrate buffer (pH 4.5). To prove the development of diabetes, blood glucose levels were measured by a Rightest GM500 blood glucose meter on the 20th day after administration of alloxan. There were used animals with medium severity diabetes (fasting glucose test showings 10 to 20 mmol/l). The experimental animals were euthanized by ethereal anesthesia decapitation. Samples of the liver, heart, and kidneys for histological examination were taken on the 20th day after administration of alloxan. Histologic sections were prepared according to the standard method, coloring was made by hematoxylin and eosin and based on Van Gizon method. We have found that on the 20th day after the simulation of alloxan diabetes, the liver showed microscopic signs of hepatitis with dystrophic changes in hepatocytes and intracellular cholestasis. The kidneys showed destruction of all structural components of the glomeruli with subsequent necrosis and dystrophic changes and destruction of the epithelium of the curvy and straight tubules. The heart showed granular degeneration of cardiocytes, in some areas, and distinct swelling between the muscle fibers bundles and inside the muscle fibers bundles, infiltration of the connective tissue stroma by erythrocytes in others. We believe that it is possible to obtain the most optimal spectrum of signs peculiar for type 1 diabetes by administration of alloxan as evidenced by microscopic changes in organs. Further, this model of diabetes will be used to study the influence of cell transplantation upon the development of the disease.З метою подальшого дослідження впливу лікування на перебіг цукрового діабету, необхідне створення моделі даної патології у дослідних тварин. Важливо прослідкувати відповідність змін у органах за даної патології при клінічних випадках та експериментальному формуванні. На даний час розроблено декілька методів формування експрементального цукрового діабету у тварин, проте найчастіше використовують введення алоксану моногідрату. Тому метою нашого дослідження було: дослідити мікроскопічні зміни в печінці, серці і нирках щурів за алоксанового цукрового діабету. Експериментальну модель цукрового діабету відтворювали шляхом одноразового підшкірного введення алоксану моногідрату в дозі 150 мг/кг у вигляді 5% розчину на цитратному буфері (рН 4,5). Для підтвердження розвитку цукрового діабету рівень глюкози крові визначали на 20 добу після введення алоксану за допомогою глюкометра Rightest GM500. В експерименті використовували тварин із цукровим діабетом середньої важкості (з рівнем глюкози крові натще від 10 до 20 ммоль/л). Евтаназію дослідних тварин здійснювали шляхом декапітації під ефірним наркозом. Відбір проб печінки, серця та нирок для гістологічних досліджень здійснювали на 20-ту добу після введення алоксану. Підготовку гістозрізів проводили за стандартною методикою, фарбування проводили гематоксиліном і еозином та за методом Ван Гізон. У процесі дослідження нами встановлено, що у печінці на 20-ту добу після моделювання алоксанового цукрового діабету встановлюють мікроскопічні ознаки гепатиту, який супроводжується дистрофічними змінами гепатоцитів і внутрішньочасточковим застоєм жовчі. У нирках щурів відбувалось руйнування всіх структурних компонентів клубочків з наступним їх некрозом, а також дистрофічні зміни й руйнування епітелію звивистих і прямих канальців. У серці виявляли зернисту дистрофію кардіоцитів, в одних ділянках та  виразний набряк між пучками м’язових волокон і всередині пучків м’язових волокон, інфільтрацію сполучнотканинної строми еритроцитами у інших. На нашу думку найоптимальніший спектр ознак, характерних для цукрового діабету І типу, можливо отримати шляхом введення алоксану, що підтверджено мікроскопічними змінами у органах. У подальшому дана модель цукрового діабету використовуватиметься для вивчення впливу клітинної трансплантації на перебіг захворювання

INFLUENCE ALLOGENEIC MESENCHYMAL STEM CELLS IN PERITONEAL MACROPHAGES OKSYHENZALEZHNYY METABOLISM MICE S57BL / 6

Дослідження проводили на самцях мишей C57BL/6 масою 20–22 г віком 2–3 місяці. Алогенні МСК отримували культивуванням первинного матеріалу, що був виділений з кісткового мозку мишей С57BL/6. Культивування клітин проводили  у середовищі DMEM з додаванням 20 % фетальної сироватки бичків (FBS) та 1 % суміші антибіотика-антимікотика (Sigma, USA) за 37°С, 100 % вологості і 5 % СО2.Мишам С57BL/6 внутрішньом’язово інокулювали клітинну суспензію метастатичної карциноми легень Льюїс (LLC) у концентрації 1×106/0,1 мл розчину Хенкса. На 8-му добу після інокуляції пухлинних клітин групі тварин вводили  внутрішньовенно алогенні МСК в концентрації 1,25×104 на тварину. Після цього було сформовано такі групи тварин: 1-ша включала інтактних тварин (контроль), 2-га включала тварин, яким вводили тільки  алогенні мезенхімальні стовбурові клітини (MSC), 3-тя включала тварин, яким вводили суспензію метастатичної карциноми легень Льюїс (LLC), 4-та – тварини, яким вводили суспензію метастатичної карциноми легень Льюїс  і  алогенні МСК (LLC+ MSC).Для визначення оксигензалежної біоцидності перитонеальних макрофагів  застосовували спонтанний та стимулювальний НСТ-тест.Встановлено, що введення  алогенних МСК чинить вплив на оксигензалежний метаболізм перитонеальних макрофагів у мишей С57BL/6. Застосування алогенних МСК забезпечує вірогідне зниження метаболічної активності перитонеальних макрофагів  у мишей С57BL/6 з показником  стимуляції  -12% , що вказує  на відсутність функціонального резерву клітин. Встановлено вірогідне зниження метаболічної активності перитонеальних макрофагів  у мишей С57BL/6 з перещепленою карциномою легень Льюїс з показником  стимуляції  -30% , що вказує  на відсутність функціонального резерву клітин.  Введення алогенних МСК призводить до  вірогідного  незначного підвищення метаболічної активності перитонеальних макрофагів  у мишей С57BL/6 з перещепленою карциномою легень Льюїс із показником  стимуляції –  8% , що вказує  на наявність функціонального резерву клітин.Исследования проводили на самцах мышей C57BL/6 массой 20–22 г в возрасте 2–3 месяца. Аллогенные МСК получали культивированием первичного материала, который был выделен из костного мозга мышей С57BL/6. Культивирование клеток проводили в среде DMEM с добавлением 20% фетальной сыворотки бычков (FBS) и 1% смеси антибиотика-антимикотика (Sigma, USA) при 37 °С, 100% влажности и 5% СО2.Мышам С57BL/6 внутримышечно вводили клеточную суспензию метастатической карциномы легких Льюис (LLC) в концентрации 1×106/0,1 мл раствора Хэнкса. На 8-е сутки после инокуляции опухолевых клеток группе животных вводили внутривенно аллогенные МСК в концентрации 1,25×104 на животное. После этого было сформировано следующие группы животных: 1-я включала интактных животных (контроль), 2-я включала животных, которым вводили только аллогенные мезенхимальные стволовые клетки (МСК), 3-я включала животных, которым вводили суспензию метастатической карциномы легких Льюис (LLC), 4-я – животные, которым вводили суспензию метастатической карциномы легких Льюис и аллогенные МСК (LLC + MSC).Для определения оксигензависимой биоцидности перитонеальных макрофагов применяли спонтанный и стимулированный НСТ-тест.Установлено, что введение аллогенных МСК оказывает влияние на оксигензависимый метаболизм перитонеальных макрофагов у мышей С57BL/6. Применение аллогенных МСК обеспечивает достоверное снижение метаболической активности перитонеальных макрофагов у мышей С57BL/6 с показателем стимуляции -12%, что указывает на отсутствие функционального резерва клеток. Установлено достоверное снижение метаболической активности перитонеальных макрофагов у мышей С57BL/6 с первитой карциномой легких Льюис с показателем стимуляции  -30%, что указывает на отсутствие функционального резерва клеток. Введение аллогенных МСК приводит к достоверному незначительного повышению метаболической активности перитонеальных макрофагов у мышей С57BL / 6 с перевитой карциномой легких Льюис с показателем стимуляции – 8%, что указывает на наличие функционального резерва клеток.The study was conducted on male mice C57BL/6 weighing 20-22 g aged 2-3 months. Receiving allogeneic MSCs cultivation of primary material that was isolated from the bone marrow of mice C57BL/6. Cultivation of cells was carried out in DMEM medium with addition of 20% fetal bovis serum (FBS) and 1% antibiotic-antimycotics (Sigma, USA) at 37 °C, 100% humidity and 5% CO2.It was inoculated intramuscularly cell suspension metastatic Lewis lung carcinoma (LLC) in a concentration 1×106/0.1 ml Hanks to mice C57BL/6. On the 8th day after tumor cell inoculation it was administered intravenously allogeneic MSCs in a concentration 1,25×104  to 4th  group of animals. After that was formed following groups of animals: 1st included intact animals (control), 2nd – included animals which was administered only allogeneic mesenchymal stem cells (MSC), 3rd  – included animals which was administered suspension metastatic Lewis lung carcinoma (LLC ),  4th  group  – which was administered suspension metastatic Lewis lung carcinoma and allogeneic MSCs (LLC + MSC).Spontaneous and stimulated oxidative metabolism of peritoneal macrophages were established  in NBT-test.It was established that administration  allogeneic MSCs   influence on  oxidative metabolism of peritoneal macrophages in mice C57BL/6. The use of allogeneic MSCs provides a probable decrease metabolic activity of peritoneal macrophages in miceC57BL/6 with stimulation  index -12%. It was indicate  that  cells lose of functional reserve. In mice with  Lewis lung carcinoma ( 3rd  group of animals)  metabolic activity of peritoneal macrophages in mice C57BL/6   was decreased  with stimulation  index  -30% like  indicating a losek of cells. functional reserve.Allogeneic MSCs application in mice C57BL/6 perescheplenoyu Lewis lung carcinoma is lead to a slight increase metabolic activity of peritoneal macrophages   with stimulation  index  8%, which indicates the presence of cells functional reserve

МОРФОМЕТРИЧНІ ЗМІНИ В СЕРЦІ ЩУРІВ ЗА ІНФАРКТУ МІОКАРДА ПРИ ВВЕДЕННІ СТОВБУРОВИХ КЛІТИН

В данной статье представлена модель ишемического инфаркта миокарда у крыс и приведены результаты исследования микроструктурных изменений в нем на разных сроках после моделирования патологического процесса. На основе микроструктурных изменений миокарда на фоне ишемического инфаркта отмечена стадийность процесса, что в свою очередь позволяет определить оптимальное время использования клеточнозаместительной терапии при данной патологии. Определено, что процесс течения инфаркта осложняется расширением ишемической зоны. Исследовано макроскопические изменения в сердце крысы при экспериментально сформированом инфаркте миокарда при введении мезенхимальных стволовых клеток (МСК), среды Игла модифицированного Дюльбеко (ДМЕМ) и у неоперированых животных. Исследовано влияние МСК на развитие инфаркта миокарда у крыс. Установлено, что процесс течения инфаркта осложняется расширением ишемической зоны. Установлена достоверный положительный терапевтический эффект после трансплантации МСК в зону ишемии, который характеризуется уменьшением площади некротизированных участков, и ускорением развития рубца.This article presents a model of ischemic myocardial infarction in rats and results of research microstructural changes in it in different terms after modeling the pathological process. Based on the microstructural changes in myocardial ischemic myocardial background process stages followed, which in turn determines the optimum using cell replacement therapy in this condition. That the process is complicated course of myocardial ischemic zone expansion. Compared macroscopic changes in the rat heart by experimental myocardial infarction formed by the introduction of mesenchymal stem cells (MSC), medium Igla modified Dyulbeko (DMEM) and not operated animals. Іnvestigated effect of MSCs on the development of myocardial infarction in rats. That the process is complicated course of myocardial ischemic zone expansion. The authentic positive therapeutic effect after transplantation of MSCs in the ischemic area, which is characterized by a decrease in the area of necrotic areas and advance the development of scar.У даній статті представлена модель ішемічного інфаркту міокарда у щурів та наведені результати дослідження мікроструктурних змін у  ньому  на різних строках після моделювання патологічного процесу. На основі мікроструктурних змін міокарда на фоні ішемічного інфаркту відмічено стадійність процесу, що у свою чергу дозволяє визначити оптимальний час використання клітиннозамісної терапії при даній патології. Встановлено, що процес перебігу інфаркту ускладнюється розширенням ішемічної зони.  Досліджено макроскопічні зміни у серці щурів за експериментально сформованого інфаркту міокарда за введення мезенхімальних стовбурових клітин (МСК), середовища Ігла модифікованого Дюльбеко (ДМЕМ) та у неоперованих тварин. Досліджено вплив МСК на розвиток інфаркту міокарда у щурів. Встановлено достовірний позитивний терапевтичний ефект після трансплантації МСК в зону ішемії, який характеризується зменшенням площі некротизованої ділянки, та прискоренням розвитку рубця