Hybridization properties and enzymatic replication of oligonucleotides containing the photocleavable 7-nitroindole base analog

Universal DNA base analogs having photocleavable properties would be of great interest for development of new nucleic acid fragmentation tools. The photocleavable 7-nitroindole 2′-deoxyribonucleoside d(7-Ni) was previously shown to furnish a highly efficient approach to photochemically trigger DNA backbone cleavage at preselected position when inserted in a DNA fragment. In the present report, we examine its potential use as universal DNA nucleoside, by analogy with the 5-nitroindole analog that is generally considered as universal base. The d(7-Ni) phosphoramidite was incorporated into oligonucleotides. Hybridization properties of resulting 11mer duplexes indicated a behavior close to that of the 5-nitroindole analog. Enzymatic recognition by Klenow fragment exonuclease-free using 40mers containing the unnatural bases as templates indicated notably a decrease of the polymerase activity with preferential incorporation of dAMP opposite both the 7-Ni and 5-Ni bases. Incorporation of the d(7-Ni) triphosphate was also studied indicating absence of significant differences between the incorporation kinetics opposite each natural base in the template. All the hybridization and enzymatic data indicate that 7-nitroindole can be considered as a cleavable base analog, although not strictly fulfilling, like the 5-nitro isomer, all properties required for a universal base

Oligonucleotide−Oligospermine Conjugates (Zip Nucleic Acids): A Convenient Means of Finely Tuning Hybridization Temperatures

Synthesis of oligonucleotide probes and control of their hybridization temperature are key aspects of polymerase chain reaction (PCR)-based detection of genetic sequences. A straightforward means to approach the last goal is to decrease the repulsion between the polyanionic probe and target strands. To this end, we have developed a versatile automated synthesis of oligonucleotide−oligospermine derivatives that gave fast access to a large variety of compounds. Plots of their hybridization temperatures Tm vs overall charge provided a measure of the impact of interstrand phosphate repulsion (and of spermine-mediated attraction) on the main driving force of duplex formation, i.e., base pairing. It showed that stabilization brought about by excess cationic charges can be of larger absolute magnitude than interstrand repulsion, even in high salt media. Base sequence and conjugation site (3′ or 5′) hardly influenced the effect of spermine on Tm. In typical PCR probe conditions, the Tm increased linearly with the number of grafted spermines (e.g., 6.2 °C per spermine for a decanucleotide probe). The large data set of Tm vs number of spermines and oligonucleotide length allowed us to empirically derive a simple mathematical relation that is accurately predicting the Tm of any oligonucleotide−oligospermine derivative. Zip nucleic acids (ZNA) are thus providing an interesting alternative to locked nucleic acids (LNA) or minor groove binders (MGB) for raising the stability of 8−12-mer oligonucleotides up to ca. 70 °C, the level required for quantitative PCR experiments

Cationic siRNAs Provide Carrier-Free Gene Silencing in Animal Cells

siRNA-mediated gene silencing requires intracellular delivery of the nucleic acid. We have developed a carrierless molecular approach that follows the same cell entry route as cationic supramolecular complexes, yet should avoid the extracellular barriers encountered by nanoparticles. Cationic oligospermine−oligonucleotide conjugates (ZNAs, for Zip Nucleic Acids) were synthesized stepwise on an oligonucleotide synthesizer using a DMT-spermine phosphoramidite derivative. They were shown to enter cells and have access to the cytoplasm, provided their formal charge ratio N/P was >1.5. Cationic siRNAs that fulfilled this condition were shown to achieve selective inhibition of luciferase gene expression in the submicromolar concentration range in constitutively luciferase-expressing cells

Zip Nucleic Acids: new high affinity oligonucleotides as potent primers for PCR and reverse transcription

Most nucleic acid-based technologies rely upon sequence recognition between an oligonucleotide and its nucleic acid target. With the aim of improving hybridization by decreasing electrostatic repulsions between the negatively charged strands, novel modified oligonucleotides named Zip nucleic acids (ZNAs) were recently developed. ZNAs are oligonucleotide–oligocation conjugates whose global charge is modulated by the number of cationic spermine moieties grafted on the oligonucleotide. It was demonstrated that the melting temperature of a hybridized ZNA is easily predictable and increases linearly with the length of the oligocation. Furthermore, ZNAs retain the ability to discriminate between a perfect match and a single base-pair-mismatched complementary sequence. Using quantitative PCR, we show here that ZNAs are specific and efficient primers displaying an outstanding affinity toward their genomic target. ZNAs are particularly efficient at low magnesium concentration, low primer concentrations and high annealing temperatures, allowing to improve the amplification in AT-rich sequences and potentially multiplex PCR applications. In reverse transcription experiments, ZNA gene-specific primers improve the yield of cDNA synthesis, thus increasing the accuracy of detection, especially for genes expressed at low levels. Our data suggest that ZNAs exhibit faster binding kinetics than standard and locked nucleic acid-containing primers, which could explain why their target recognition is better for rare targets

Synthèse et évaluation d'oligonucléotides conjugués à des polyamines

Ce travail porte sur la synthèse et l évaluation d oligonucléotides conjugués à des polyamines. Dans un premier temps, une polyamine naturelle, la spermine a été couplée répétitivement à l extrémité 3 d un oligonucléotide grâce à une nouvelle stratégie de conjugaison : la formation d une liaison guanidine inter spermines. Jusqu à 3 résidus polyaminés ont ainsi été ajoutés à un décamère. Ces conjugués présentent une affinité améliorée pour des oligonucléotides de séquences complémentaires. Toutefois, leur synthèse demande à être perfectionnée pour obtenir des composés de charge globale cationique. Dans un deuxième temps, des oligonucléotides antisens présentant un squelette modifié 2 OMe phosphorothioate ont été couplés en 5 à des spermines par la chimie des phosphoramidites. Ces oligonucléotides, cationiques, ont montré une internalisation cellulaire sans agent de transfection et une efficacité biologique sur un modèle in vitro de correction de l épissage alternatif. Enfin, des siRNAs cationiques ont été synthétisés et conjugués à des résidus lipidiques. Ces parties lipophiles servent d ancres pour pré associer les siRNAs avec une protéine sérique, l albumine, afin de les protéger in vivo de la dégradation par les nucléases. Leur capacité à se présenter sous forme de molécules isolées ou à s auto assembler, et leur interaction avec l albumine ont été caractérisées par microscopie électronique en transmission. Ces siRNAs sont capables d éteindre l expression d un gène (ca 90%) in vitro sans agent de transfection, y compris en présence de sérum. Leur pré association avec l albumine n affecte en rien leur efficacité.This work consists in synthesis and evaluation of oligonucleotides polyamines conjugates. First, a natural polyamine, the spermine, was repetitively coupled to the 3 end of an oligonucleotide through novel conjugation chemistry, resulting in the formation of a guanidine inter spermine link. Up to three spermine residues could thus be appended to a decamer. Such conjugates exhibited increased affinity for their target sequence. However, synthetic improvements are required in order to obtain oligonucleotides with an overall cationic charge. Subsequently, antisense oligonucleotides bearing a 2 OMe phosphorothioate modified backbones were coupled to polyspermines at their 5 end, through phosphoramidite chemistry. Those cationic oligonucleotides showed carrier free cell transfection potency and efficient splicing correction in an in vitro model. Finally, cationic siRNAs were synthesized and conjugated to lipidic moieties. Lipophilic blocks would serve as anchors to pre load those siRNAs on seric protein albumin, to protect them in vivo from nuclease degradation. Ability of such conjugates to exist at a single molecule state or to self assemble as well as their interaction with albumin were characterized by Transmission Electron Microscopy (TEM). Lipophilic siRNas were able to induce gene silencing (ca 90%) without the use of any transfection agent, even in presence of serum. Preloading them on albumin did not impair their biological efficiency.STRASBOURG-Sc. et Techniques (674822102) / SudocSudocFranceF

Recherche de marqueurs spécifiques des phosphates d'acides nucléiques en vue d'application sur puces à ADN

La technologie des puces à ADN fait appel à des techniques de marquages d'acides nucléiques qui doivent être sensibles en étant le plus efficace possible. Notre travail a consisté à développer une méthode de marquage directe et efficace basée sur l'alkylation des groupements phosphates des acides nucléiques. Nous avons ainsi synthétisé une série de dérivés d'aryldiazométhanes conjugués à un marqueur. Les premières molécules décrites sont des marqueurs biotinylés pour lesquels on a fait varier la position de la biotine sur le groupement phényle comportant la fonction réactive diazométhane. L'introduction de groupements électroattracteurs a également été réalisée. D'autres molécules biotinylées comportant des chaînes polyéthylène glycol ont été synthétisées ainsi que des composés polybiotinylés. Enfin des marqueurs Cy5 ont été synthétisés dans le but de s'affranchir de l'étape de révélation de la biotine. Finalement, les résultats obtenus sur puce à ADN sont présentés.GRENOBLE1-BU Sciences (384212103) / SudocSudocFranceF

LA LESION 2-DESOXYRIBONOLACTONE (ETUDE DE LA REACTIVITE ET DES CONSEQUENCES BIOLOGIQUES DE CE DOMMAGE DE L'ADN)

LA LESION 2-DESOXYRIBOLACTONE EST UN SITE ABASIQUE DE L'ADN FORME PAR DES RAYONNEMENTS ULTRA-VIOLET OU DES IRRADIATIONS GAMMA, PAR ACTION D'ANTIBIOTIQUES TELS QUE LA NEOCARZINOSTATINE OU DE CERTAINS COMPLEXES METALLIQUES. CE DOMMAGE A LA PARTICULARITE D'ETRE ALCALI-LABILE ET DE GENERER DES COUPURES DE BRINS D'ADN. UN DES BUTS DU TRAVAIL PRESENTE A ETE LA MISE AU POINT D'UNE VOIE DE SYNTHESE GENERALE ET QUANTITATIVE DE CETTE LESION A PARTIR D'UN PRECURSEUR PHOTOREACTIF INCORPORE DANS DES OLIGONUCLEOTIDES DE LONGUEUR VARIABLE. LES OLIGONUCLEOTIDES SYNTHETISES CONSTITUENT UN OUTIL DE CHOIX POUR L'ETUDE DE LA REACTIVITE CHIMIQUE OU BIOLOGIQUE DU DOMMAGE, OU L'ETUDE DU CARACTERE ALCALI-LABILE DE LA 2-DESOXYRIBONOLACTONE. DES DUREES DE DEMI-VIE DE LA LESION EN FONCTION DU PH, DE LA TEMPERATURE OU DE LA LONGUEUR DU FRAGMENT D'ADN ONT ETE MESUREES. CES INFORMATIONS ONT PERMIS DE METTRE AU POINT LES CONDITIONS EXPERIMENTALES APPROPRIEES POUR L'ETUDE DE LA SYNTHESE TRANSLESIONNELLE D'ADN ET DE LA REPARATION IN VITRO DE LA LESION, CE QUI CONSTITUE LA DEUXIEME PARTIE DE CE TRAVAIL. NOUS AVONS ETUDIE L'ACTIVITE DE TROIS ADN POLYMERASES ET DE DIFFERENTES ENZYMES, PRESENTES CHEZ E. COLI OU CHEZ L'HOMME, CHARGEES DE LA REPARATION D'UNE AUTRE LESION ABASIQUE : LE SITE 2-DESOXYRIBOSE. LES RESULTATS OBTENUS SUR L'ACTIVITE DES AP-ENDONUCLEASES DE TYPE II LAISSENT PRESAGER QUE CES ENZYMES SONT DE BONNES CANDIDATES A LA REPARATION IN VIVO DE LA 2-DESOXYRIBONOLACTONE PUISQUE L'ACTIVITE DETECTEE IN VITRO EST SEMBLABLE A CELLE OBTENUE SUR LE SUBSTRAT DE PREDILECTION DE CES ENZYMES : LE SITE 2-DESOXYRIBOSE. D'AUTRE PART, LA SYNTHESE TRANSLESIONNELLE D'ADN, CATALYSEE PAR LES ENZYMES QUE NOUS AVONS TESTEES, MET EN EVIDENCE L'INCORPORATION PREFERENTIELLE DE DAMP FACE A LA LESION PAR CERTAINES POLYMERASES. LA REGLE DU A DECRITE POUR D'AUTRES LESIONS, EST DONC EGALEMENT VALABLE POUR LA LESION 2-DESOXYRIBONOLACTONE.GRENOBLE1-BU Sciences (384212103) / SudocSudocFranceF

Développement d'une nouvelle méthode de fragmentation de l'ADN via l'incorporation de nucléotides modifiés

GRENOBLE1-BU Sciences (384212103) / SudocSudocFranceF