Cas9-induced on-target genomic damage

CRISPR/Cas9 is the gene editing tool of choice in basic research and poised to become one in clinical context. However, current studies on the topic suffer from a number of shortcomings. Mutagenesis is often assessed using bulk methods, which means rare events go undetected, unresolved or are discarded as potential sequencing errors. Many of the genotyping methods rely on short-range PCR, which excludes larger structural variants. Other methods, such as FISH, do not provide basepair resolution, making the genotype assessment imprecise. Furthermore, it is not well understood how Cas9 delivery format influences the dynamics of indel introduction. Finally, many studies of on-target activity were conducted in cancerous cell lines, which do not accurately model the mutagenesis of normal cells in the therapeutic context. In my thesis, I have investigated on-target lesions induced by Cas9 complexed with single gRNAs and no exogenous template. I have followed the time dynamics of Cas9-induced small indels as a function of reagent delivery methods, established an assay for quantification of Cas9-induced genomic lesions that are not small indels ("complex lesions") and used this assay to isolate and genotype complex lesions, many of which would be missed by standard methods. I found that DNA breaks introduced by single guide RNAs frequently resolved into deletions extending over many kilobases. Furthermore, lesions distal to the cut site and cross-over events were identified. Frequent and extensive DNA damage in mitotically active cells caused by CRISPR/Cas9 editing may have pathogenic consequences.Wellcome Trust Grant number 09805

ERCC1-deficient cells and mice are hypersensitive to lipid peroxidation

Lipid peroxidation (LPO) products are relatively stable and abundant metabolites, which accumulate in tissues of mammals with aging, being able to modify all cellular nucleophiles, creating protein and DNA adducts including crosslinks. Here, we used cells and mice deficient in the ERCC1-XPF endonuclease required for nucleotide excision repair and the repair of DNA interstrand crosslinks to ask if specifically LPO-induced DNA damage contributes to loss of cell and tissue homeostasis. Ercc1-/- mouse embryonic fibroblasts were more sensitive than wild-type (WT) cells to the LPO products: 4-hydroxy-2-nonenal (HNE), crotonaldehyde and malondialdehyde. ERCC1-XPF hypomorphic mice were hypersensitive to CCl4 and a diet rich in polyunsaturated fatty acids, two potent inducers of endogenous LPO. To gain insight into the mechanism of how LPO influences DNA repair-deficient cells, we measured the impact of the major endogenous LPO product, HNE, on WT and Ercc1-/- cells. HNE inhibited proliferation, stimulated ROS and LPO formation, induced DNA base damage, strand breaks, error-prone translesion DNA synthesis and cellular senescence much more potently in Ercc1-/- cells than in DNA repair-competent control cells. HNE also deregulated base excision repair and energy production pathways. Our observations that ERCC1-deficient cells and mice are hypersensitive to LPO implicates LPO-induced DNA damage in contributing to cellular demise and tissue degeneration, notably even when the source of LPO is dietary polyunsaturated fats

Contribution of lipid peroxidation in cellular response to DNA damage and Fanconi anemia

STRESZCZENIE Niedokrwistość Fanconiego (FA) to rzadka choroba genetyczna, dziedziczona w sposób autosomalnie recesywny lub sprzężony z chromosomem X. Pacjenci z FA posiadają liczne zaburzenia rozwojowe (hematopoeza) i deformacje (układ kostny) oraz częściej, niż ludzie zdrowi zapadają na nowotwory (białaczki). Komórki pacjentów z zespołem FA są nadwrażliwe na czynniki sieciujące DNA (np. mitomycynę C, czy cis-platynę) i charakteryzuje je wysoka niestabilność genomowa oraz bardzo często status prooksydacyjny. Fenotyp chorobowy związany jest z mutacjami w obrębie genów kodujących 16 białek, które wchodzą w skład szlaku Fanconiego. Szlak FA uruchamiany zostaje podczas stresu replikacyjnego, a białka wchodzące w jego skład koordynują naprawę międzyniciowych wiązań krzyżowych DNA (ICL) i stabilizują widełki replikacyjne, zapewniając integralność genomową. Pomimo bogatej wiedzy na temat choroby, etiologia zespołu FA nie jest jeszcze do końca poznana. Do dziś, nie udało się zidentyfikować m. in. endogennych substratów dla białek szlaku Fanconiego. Status prooksydacyjny komórek FA-/- sprzyja wzrostowi poziomu wolnych rodników tlenowych (ROS), co może prowadzić do uruchomienia procesu peroksydacji lipidów (LPO) i powstania reaktywnych aldehydów, wśród których znajduje się 4-hydroksynonenal (HNE). Wolne rodniki tlenowe oraz produkty LPO modyfikują składniki komórki, w tym zasady DNA, wprowadzając uszkodzenia oksydacyjne i alkilacyjne. HNE jest cząsteczką sygnałową regulującą wiele procesów biologicznych komórki poprzez interakcje z biomolekułami, tworząc addukty do białek i DNA, a wśród nich najbardziej toksyczne dla komórki, ICL. Liczne spekulacje środowiska naukowego i zebrana dotychczas wiedza pozwalają przypuszczać, że produkty LPO (w tym HNE) są dobrymi kandydatami na indukcję endogennych substratów białek ścieżki Fanconiego. Niniejsza praca ma aspekt dwuwymiarowy. Po pierwsze, jest próbą wyjaśnienia w jaki sposób stres oksydacyjny, a szczególnie związana z nim peroksydacja lipidów i powstające endogennie uszkodzenia DNA przyczyniają się do wystąpienia objawów i postępu niedokrwistości Fanconiego. Po wtóre, jest studium nad wpływem peroksydacji lipidów na podstawowe procesy biologiczne, a w szczególności na (i) kształtowanie się odpowiedzi na uszkodzenia DNA (DDR) oraz na (ii) mechanizmy naprawy uszkodzeń DNA. Podczas prowadzonych badań wykazano, że zarówno ludzkie komórki HeLa, jak i kurze DT40 WT są wrażliwe na 4-hydroksynonenal, przy czym mutanty DT40 poszczególnych kompleksów szlaku FA są nadwrażliwe na HNE w stosunku do linii typu podstawowego. Być może obserwowane zjawisko związane jest z indukcją endogennych uszkodzeń DNA przez produkty LPO. W niniejszej pracy pokazano, że w obecności HNE, w komórce dochodzi do powstania pojedynczoniciowych i podwójnoniciowych (SSB i DSB) pęknięć DNA, niewielkiej liczby międzyniciowych wiązań krzyżowych (ICL) oraz indukcji oksydacyjnych uszkodzeń DNA. Wykazano również, że obecność endogennych uszkodzeń DNA, indukowanych przez HNE prowadzi do stresu replikacyjnego i spowolnienia postępu widełek replikacyjnych, silniejszego w badanych mutantach DT40 FA-/-, niż w komórkach WT. Następnie przebadano aktywację szlaku Fanconiego i systemu odpowiedzi na uszkodzenia DNA (DDR) indukowane wyłącznie przez 4-hydroksynonenal oraz inne związki (kamptotecynę CPT i hydroksymocznik HU) w obecności HNE. W przeciwieństwie do hydroksymocznika i kamptotecyny, komórka w odpowiedzi na HNE nie aktywuje szlaku Fanconiego (brak monoubikwitynacji białka FANCD2). Pokazano również, że po traktowaniu komórek HNE dochodzi do hamowania monoubikwitynacji FANCD2 indukowanej w czasie stresu replikacyjnego, wywołanego działaniem kamptotecyny i hydroksymocznika. Aktywacja szlaku Fanconiego zależy od prawidłowej sygnalizacji (fosforylacja) w obrębie systemu odpowiedzi na uszkodzenia DNA (DDR). W skutek działania kamptotecyny i hydroksymocznika dochodziło do prawidłowej aktywacji systemu DDR, tj. w przypadku CPT uruchomienie dwóch wewnętrznych ścieżek, związanych z odpowiedzią na obecność pęknięć DNA (ATM-CHK2-H2AX-RPA) oraz odpowiedzią na stres replikacyjny (ATR-CHK1-FANCD2), a w przypadku HU włączenia samej odpowiedzi na stres replikacyjny. Po potraktowaniu komórek HNE zaobserwowano na początku blokadę systemu DDR, a po 6h inkubacji uruchomienie wyłącznie ścieżki związanej z odpowiedzią na pęknięcia DNA (ATM-CHK2-H2AX-RPA). Odpowiedź DDR indukowana przez kamptotecynę i hydroksymocznik, ulega również w obecności HNE hamowaniu, co pokazuje spadek poziomu fosforylacji białek, składowych ścieżek ATM-CHK2-H2AX-RPA i ATR-CHK1. Pokazano również, że w obecności HNE spada poziom fosforylacji, innych niż białka CHK, substratów nadrzędnych kinaz DDR (ATM/ATR), KAP1 i SMC1, aktywowanych przez CPT, natomiast podczas działania samego HNE w ogóle nie dochodzi do ich fosforylacji. Przeprowadzone badania wykazały również, że odzyskanie pełnej funkcjonalnej aktywności DDR, blokowanej przez HNE trwa 24h. Po 6h od traktowania komórek HNE zaobserwowano także (i) akumulację komórek w fazie G2 cyklu komórkowego i (ii) aktywację kinazy DNA PKcs, co może świadczyć o uruchomieniu naprawy pęknięć DNA na drodze rekombinacji niehomologicznej (NHEJ). Pokazano również, że głównie po 2h od traktowania komórek HNE wzrasta ekspresja polimeraz systemu TLS (w komórkach WT ζ, w komórkach FANCM -/- κ, θ, ζ) oraz genów systemu ALKB (głównie ALKB2), które mogą naprawiać lub niwelować szkodliwe skutki obecności adduktów HNE do DNA w komórce. Działanie HNE skutkuje zaburzeniem odpowiedzi DDR prowadząc m. in do braku aktywacji ścieżki FA i mechanizmu rekombinaji homologicznej (HR), czyli nieefektywnej koreplikacyjnej naprawy uszkodzeń DNA i promowania szybkiej i niedokładnej naprawy (NHEJ, TLS). Podczas realizacji badań wykazano również, że HNE rozregulowuje proces transkrypcji, wpływając zarówno na poziom, jak i aktywność białka EGFP systemu reporterowego. Obecność HNE indukuje również apoptozę, a w przypadku wstępnej inkubacji i dalszego działania innych związków toksycznych dla komórki nasila proces programowanej śmierci. Reasumując, rola peroksydacji lipidów w etiologii zespołu Fanconiego wydaje się być istotna. HNE indukuje stres oksydacyjny i wprowadza uszkodzenia do DNA. Jednocześnie oddziałując z białkami zaburza procesy fizjologiczne komórki, w tym (i) moduluje aktywność systemu detekcji uszkodzeń (DDR) ograniczając możliwości dokładnej naprawy uszkodzeń DNA i (ii) moduluje status redoks komórki. Niedokładna naprawa uszkodzeń DNA indukowanych oraz pochodzenia endogennego może przyczynić się do postępu zespołu Niedokrwistości Fanconiego poprzez (i) nasilenie procesu apoptozy, prowadzącego do zaburzeń rozwojowych lub (ii) pojawienie się mutacji sprzyjających indukcji nowotworowej.ABSTRACT Fanconi Anemia (FA) is a rare genetic disease inherited in an autosomal recessive manner, or linked to the X chromosome. Patients with FA have numerous developmental disorders (hematopoesis) and deformations (the skeleton), and are predisposed to cancer, particularly leukemias. The cells of FA patients are hypersensitive to crosslinking agents (e.g. mitomycine C or cis-platinium), and are characterized by high genomic instability as well as prooxidative status. FA phenotype is linked to mutations in genes coding for 16 proteins that create a Fanconi pathway. FA pathway is activated by replicative stress, and proteins which constitute the system are engaged in coordination of interstrand DNA crosslinks (ICL), and stabilize replicative forks, thus ensuring genomic stability. In spite of a quite large knowledge about the disease, the ethiology of FA syndrome is not well known. For example, endogenous substrates for FA proteins were not identified. Prooxidative status of FA-/- cells favours increase of the level of reactive oxygen species (ROS), which may which may lead to lipid peroxidation (LPO) and formation of reactive aldehydes, like 4-hydroxynonenal (HNE). ROS as well as LPO products modify cellular components, including DNA bases, in this way introducing oxidative and alkyl DNA lesions. HNE is a signalling molecule, which regulates several biological processes by interacting with and forming adducts to proteins and DNA bases, among which the most toxic to the cell are ICLs. Recently, it was speculated that LPO products (including HNE) are probable to induce endogenous substrates for the Fanconi pathway. This work is twodimentional. First, it attempts to explain how oxidative stress, and particularly endogenous DNA lesions formed during lipid peroxidation contribute to syndromes and progression of Fanconi Anemia. Second, this dissertation studies the effect of lipid peroxidation on the basic biological processes, particularly such as (i) activation of DNA damage response (DDR), and (ii) the mechanisms of DNA repair. This work shows that both human HeLa and chicken DT40 cells are sensitive to HNE, and DT40 mutants in three different complexes of FA pathway are more sensitive to HNE than the wild type cells. This may be caused by an inability of FA mutants to repair endogenous damage induced by LPO products. Here was also shown that HNE induces in cells single-, and double strand breaks (SSB and DSB), as well as a small quantity of interstrand crosslinks (ICL) and oxidative DNA damage. The presence of DNA lesions induced by HNE leads to replicative stress and slowing down of progression of replicative forks, which was stronger in DT40 FA-/- mutants than in wild type cells. Subsequently, FA pathway DNA damage response (DDR) activation by 4-hydroxynonenal itself and in combination with other genotoxins (camptotecin, CPT and hydroxyurea, HU). In contrast to hydroxyurea and camptothecin, in response to HNE the cell does not activate FA pathway (lack of FANCD2 monoubiquitination). It was also shown that pretreatment of cells with HNE inhibits FANCD2 monoubiquitination, which occurs during replicative stress induced by CPT or HU. FA pathway activation depends on the proper signalization (phosphorylation) within DNA damage response system (DDR). Camptothecin and hydroxyurea alone activated properly DDR. CPT activated both internal pathways, related to DNA strand breaks (ATM-CHK2-H2AX-RPA), and replicative stress pathway (ATR-CHK1-FANCD2). Hydroxyurea activated only replicative stress pathway. Treatment of cells with HNE resulted first in the blockage of the DDR system, and 6 h after treatment activation of only DDR pathway related to DNA breaks (ATM-CHK2-H2AX-RPA). DDR response induced by CPT and HU was also inhibited by HNE, which was visualized by the decrease of the level of phosphorylated proteins within ATM-CHK2-H2AX-RPA and ATR-CHK1-FANCD2 DDR pathways. It was also shown that in the presence of HNE camptothecin indcuces lower amount of phosphorylated substrates of ATR/ATM, other than CHK, such as KAP1 and SMC1. In the presence of HNE alone KAP1 and SMC1 are not phosphorylated at all. It was also shown here that a cell needs 24 h for re-gaining of DDR function after HNE treatment. It was also observed that 6 h after HNE treatment (i) cells are accumulating in G2 phase of the cells cycle; (ii) DNA-PKcs is activated, which may indicate activation double-strand break repair by non-homologous end-joining (NHEJ). It was also shown that 2 h after HNE treatment mRNA level of TLS DNA polymerases increases (in wild type cells Pol , in FANCM-/- pol , , ), as well as ALKB2 gene, which may reduce adverse effects of the presence of DNA lesions induced by HNE. HNE action on the cell results in disordered DNA damage response, which leads to the lack of activation of the FA pathway and homologous recombination and promotion of quick, low fidelity NHEJ and TLS pathways. It was also demonstrated that HNE deregulates transcription, and affects the level as well as the activity of reporter EGFP protein. The presence of HNE also induces apoptosis, which is significantly augmented in the presence of other genotoxic compounds. Summing up, the role of lipid peroxidation in the ethiology of Fanconi Anemia seems to be important. HNE induces oxidative stress and introduces DNA lesions. Simultaneously, by interacting with proteins it affects cellular physiological processes, including: (i) modulation of DNA damage response (DDR), which limits the possibility of accurate DNA repair, and (ii) modulation of the cellular redox status. Low fidelity repair of endogenous DNA lesions may result in either accelerated apoptosis and developmental disorders or mutations and induction of cancer, which are both observed in Fanconi Anemia

Differential repair of etheno-DNA adducts by bacterial and human AlkB proteins

AlkB proteins are evolutionary conserved Fe(II)/2-oxoglutarate-dependent dioxygenases, which remove alkyl and highly promutagenic etheno(ε)-DNA adducts, but their substrate specificity has not been fully determined. We developed a novel assay for the repair of ε-adducts by AlkB enzymes using oligodeoxynucleotides with a single lesion and specific DNA glycosylases and AP-endonuclease for identification of the repair products. We compared the repair of three ε-adducts, 1,N6-ethenoadenine (εA), 3,N4-ethenocytosine (εC) and 1,N2-ethenoguanine (1,N2-εG) by nine bacterial and two human AlkBs, representing four different structural groups defined on the basis of conserved amino acids in the nucleotide recognition lid, responsible for the enzyme binding to the substrate. Two bacterial AlkB proteins, MT-2B (from Mycobacterium tuberculosis) and SC-2B (Streptomyces coelicolor) did not repair these lesions in either double-stranded (ds) or single-stranded (ss) DNA. Three proteins, RE-2A (Rhizobium etli), SA-2B (Streptomyces avermitilis), and XC-2B (Xanthomonas campestris) efficiently removed all three lesions from the DNA substrates. Interestingly, XC-2B and RE-2A are the first AlkB proteins shown to be specialized for ε-adducts, since they do not repair methylated bases. Three other proteins, EcAlkB (Escherichia coli), SA-1A, and XC-1B removed εA and εC from ds and ssDNA but were inactive towards 1,N2-εG. SC-1A repaired only εA with the preference for dsDNA. The human enzyme ALKBH2 repaired all three ε-adducts in dsDNA, while only εA and εC in ssDNA and repair was less efficient in ssDNA. ALKBH3 repaired only εC in ssDNA. Altogether, we have shown for the first time that some AlkB proteins, namely ALKBH2, RE-2A, SA-2B and XC-2B can repair 1,N2-εG and that ALKBH3 removes only εC from ssDNA. Our results also suggest that the nucleotide recognition lid is not the sole determinant of the substrate specificity of AlkB proteins

FoxA1 directs the lineage and immunosuppressive properties of a novel regulatory T cell population in EAE and MS

The defective generation or function of regulatory T (T reg) cells in autoimmune disease contributes to chronic inflammation and tissue injury. We report the identification of FoxA1 as a transcription factor in T cells that, after ectopic expression, confers suppressive properties in a newly identified T reg cell population, herein called FoxA1 + T reg cells. FoxA1 bound to the Pdl1 promoter, inducing programmed cell death ligand 1 (Pd-l1) expression, which was essential for the FoxA1 + T reg cells to kill activated T cells. FoxA1 + T reg cells develop primarily in the central nervous system in response to autoimmune inflammation, have a distinct transcriptional profile and are CD4 + FoxA1 + CD47 + CD69 + PD-L1 hi FoxP3 -. Adoptive transfer of stable FoxA1 + T reg cells inhibited experimental autoimmune encephalomyelitis in a FoxA1-and Pd-l1-dependent manner. The development of FoxA1 + T reg cells is induced by interferon-β (IFN-β) and requires T cell-intrinsic IFN-α/β receptor (Ifnar) signaling, as the frequency of FoxA1 + T reg cells was reduced in Ifnb -/- and Ifnar -/- mice. In individuals with relapsing-remitting multiple sclerosis, clinical response to treatment with IFN-β was associated with an increased frequency of suppressive FoxA1 + T reg cells in the blood. These findings suggest that FoxA1 is a lineage-specification factor that is induced by IFN-β and supports the differentiation and suppressive function of FoxA1 + T reg cells